一种癌干细胞样耐药细胞来源泛素化蛋白及其在制备抗癌药物中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种癌干细胞样耐药细胞来源泛素化蛋白及其在制备抗癌药物中的应用，其主要由以下方法制备所得：(1)利用化疗药诱导癌细胞耐药，得到富集了癌干细胞的癌干细胞样耐药细胞株；(2)将泛素化蛋白募集蛋白偶联至佐剂，得偶联佐剂；(3)培养上述癌干细胞样耐药细胞株，抑制其泛素化蛋白降解，然后利用步骤(2)所得的偶联佐剂募集泛素化蛋白，即得所述泛素化蛋白。本发明专利技术在原有基础上改变了泛素化蛋白来源，制备获得了具有癌干细胞样耐药肿瘤细胞抗原特异性的泛素化蛋白，诱导了具有癌干细胞样耐药肿瘤细胞特异性的免疫应答，并且联合STING激动剂，大大提高疫苗的治疗肿瘤的效果。

A cancer stem cell like drug-resistant cell derived ubiquitin protein and its application in the preparation of anticancer drugs

【技术实现步骤摘要】
一种癌干细胞样耐药细胞来源泛素化蛋白及其在制备抗癌药物中的应用
本专利技术涉及一种癌干细胞样耐药细胞来源泛素化蛋白及其在制备抗癌药物中的应用，属于肿瘤疫苗

技术介绍
随着肿瘤学、免疫学及分子生物学等学科的不断发展，肿瘤免疫治疗成为继手术治疗，化疗，放疗等传统治疗以外的新兴治疗方法。肿瘤免疫治疗通过激发和增强机体自身的抗肿瘤免疫应答杀伤肿瘤、抑制肿瘤生长和转移。在临床研究中，在黑色素瘤、肺癌、卵巢癌、乳腺癌等，免疫治疗已经取得了引人注目的结果，部分免疫疗法已经获得美国FDA批准。以乳腺癌为例，乳腺癌目前仍然是女性常见的癌症，是女性死亡的第二大原因，发病率也在逐年上升。目前对乳腺癌的常规治疗包括采用手术，放射治疗和化疗的传统癌症治疗方法，也包括靶向治疗和激素治疗等方法。而根据临床资料显示，乳腺癌异质性高，高转移，易复发，预后差且大部分肿瘤病人对化疗、放疗等不敏感，长期化疗和靶向治疗也会引起乳腺癌病人耐药性的产生，尤其是对于那些出现或者发展成为IV期疾病的患者，5年生存率仍然很差。因此，乳腺癌的临床治疗迫切需要新的手段和治疗策略，而近年来免疫治疗的出现有望成为治疗乳腺癌的新转机。免疫治疗包括肿瘤疫苗在内，具有靶向性强和毒副作用小等优点，在临床上取得了许多成果的试验，尤其是治疗性肿瘤疫苗越来越受到人们的关注。肿瘤疫苗发挥作用的至关重要的因素就是肿瘤相关性抗原(TAAs，tumor-associatedantigens)，肿瘤疫苗主要由专职抗原提成细胞(pAPC，professionalantigenpressingcell)交叉递呈TAAs,诱导初始T细胞应答，活化后的T细胞识别TAAs，特异性杀伤靶细胞。申请人前期研究发现，富含泛素化蛋白的自噬小体DRibble是有效的抗原载体，DRibble携带的肿瘤抗原能被DC摄取，并通过交叉提呈方式诱导特异性CD8+T细胞应答。进一步研究发现，泛素化蛋白Ub是DRibble发挥抗肿瘤作用的主要成分，申请人前期通过带有三个泛素分子结合基序(UIM)的Vx3融合蛋白(His-Vx3-eGFP)直接从富含泛素化蛋白的肿瘤细胞裂解液中富集泛素化蛋白能够在多种肿瘤模型上发挥抗肿瘤作用。为了进一步优化泛素化蛋白疫苗，申请人将His-Vx3-eGFP蛋白共价偶联至纳米铝，利用纳米铝的物理特性，可以通过一步离心法快速、简便、高效地募集泛素化蛋白，同时纳米铝作为免疫佐剂，进一步提高了泛素化蛋白的免疫效果，成功制备了“泛素化蛋白-纳米铝佐剂复合疫苗”，在荷瘤小鼠模型上可以有效的发挥抗肿瘤作用。乳腺癌病人极易发生转移和产生肿瘤耐药性，且在耐药肿瘤细胞中富集了癌干样的乳腺癌肿瘤细胞，癌干细胞是存在于肿瘤组织中的具有自我更新、增殖、分化功能的一小部分细胞群，被认为是肿瘤复发、转移以及药物耐受发生的关键因素甚至源头。发展以癌干细胞为靶点的治疗新策略，在关注肿瘤整体体积消减的同时，重点靶向癌干细胞的清除，有望克服肿瘤复发、转移以及药物耐受的发生，已成为肿瘤治疗领域的新思路。现有的常规治疗性肿瘤疫苗往往针对原发性不耐药未转移的乳腺癌，对一些晚期或发生转移或耐药的乳腺癌患者不能发挥有效的作用。
技术实现思路
专利技术目的：为了克服上述现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种癌干细胞样耐药细胞来源泛素化蛋白及其在制备抗癌药物中的应用，尤其是该泛素化蛋白联合Sting激动剂DMXAA治疗转移性癌的应用。技术方案：为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种癌干细胞样耐药细胞来源泛素化蛋白，所述耐药细胞来源泛素化蛋白主要由以下方法制备所得：(1)癌耐药细胞的建立：利用化疗药诱导癌细胞耐药，得到富集了癌干细胞的癌干细胞样耐药细胞株；(2)佐剂的修饰：将泛素化蛋白募集蛋白偶联至佐剂，得偶联佐剂；(3)募集泛素化蛋白：培养上述癌干细胞样耐药细胞株，抑制其泛素化蛋白降解，然后利用步骤(2)所得的偶联佐剂募集泛素化蛋白，即得所述癌干细胞样耐药细胞来源泛素化蛋白。步骤(1)中，所述癌细胞优选为乳腺癌细胞，所述化疗药可以选自乳腺癌病人临床常用药物包括烷化剂类(如环磷酰胺、苯丙氨酸氮芥等)、抗代谢性药物类(如氟尿嘧啶、氨甲喋呤等)、抗生素类(如阿霉素、表阿霉素、丝裂霉素C等)、生物碱类(如长春新碱、秋水仙碱等)和紫杉醇类(如多西他赛等)，优选抗生素类表阿霉素。其他类似的癌细胞也同样适用，例如所述癌细胞还可以选自肺癌细胞，利用化疗药顺铂诱导肺癌细胞耐药等。步骤(1)中，通过低浓度梯度递增联合大剂量间断冲击方法诱导癌细胞耐药，方法优选如下：培养癌细胞，待到细胞成长到55-85％时，换成含化疗药的培养基，从一开始(0.01-5)μg/ml的培养基含药浓度逐步递增到到(100-500)μg/ml，培养，每1～3天换液一次，传代。步骤(2)中，所述泛素化蛋白募集蛋白可以选自泛素抗体(如UbiquitinAntibody，K11-linkageSpecificPolyubiquitinAntibody，K48-linkageSpecificPolyubiquitinAntibody，K63-linkageSpecificPolyubiquitinAntibody等)或者泛素结合蛋白，优选泛素结合蛋白如Vx3蛋白等，进一步优选Vx3蛋白。为制备和纯化Vx3蛋白，可选用His蛋白、MyC蛋白、GST蛋白或HA蛋白等标签蛋白进行标记，优选His蛋白。所述佐剂选自纳米磷酸钙佐剂、纳米四氧化三铁佐剂、锰佐剂或纳米铝，优选纳米铝。Vx3蛋白可通过吸附或共价偶联至纳米铝佐剂，优选偶联剂共价偶联方法。更一步优选，所述偶联剂选自三乙氧基硅烷，其通过醛基连接至纳米铝佐剂，然后与His-Vx3蛋白反应，通过氨基与羧基生成稳定的碳氮双键。所述His-Vx3蛋白是可以通过以下方法制得：复苏转化了His-Vx3表达质粒的大肠杆菌，诱导其表达蛋白，采用镍离子层析法提取所述His-Vx3蛋白。所述His-Vx3蛋白为具有泛素结合结构域的Vx3(A7)融合蛋白，Vx3(A7)融合蛋白为串联了三个来源于Vps27(ayeasthomologueofHRS,Hepatocytegrowthfactor-regulatedtyrosinekinasesubstrate)的UIM(ubiquitin-interactingmotif)的人工构建体，是近年来报道的人工构建串联有泛素结合结构域的对泛素化蛋白有很高亲和力的蛋白。步骤(3)中，所述抑制泛素化蛋白降解的方法优选为：培养的癌干细胞样耐药细胞生长至75-85％，加入蛋白酶体抑制剂(如PSI、乳胞素、MG132、或硼替佐米，优选硼替佐米)和氯化铵，加入量分别为(200-500)nmol/L和(50-100)mmol/L，干预细胞100-200小时，抑制泛素化蛋白的降解。步骤(3)中，抑制耐药细胞中泛素化蛋白降解后，再经细胞裂解液处理，离心得上清液，然后与偶联纳米铝颗粒共孵育，即可募集本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种癌干细胞样耐药细胞来源泛素化蛋白，其特征在于，所述耐药细胞来源泛素化蛋白主要由以下方法制备所得：/n(1)癌耐药细胞的建立：利用化疗药诱导癌细胞耐药，得到富集了癌干细胞的癌干细胞样耐药细胞株；/n(2)佐剂的修饰：将泛素化蛋白募集蛋白偶联至佐剂，得偶联佐剂；/n(3)募集泛素化蛋白：培养上述癌干细胞样耐药细胞株，抑制其泛素化蛋白降解，然后利用步骤(2)所得的偶联佐剂募集泛素化蛋白，即得所述癌干细胞样耐药细胞来源的泛素化蛋白。/n

【技术特征摘要】
1.一种癌干细胞样耐药细胞来源泛素化蛋白，其特征在于，所述耐药细胞来源泛素化蛋白主要由以下方法制备所得：
(1)癌耐药细胞的建立：利用化疗药诱导癌细胞耐药，得到富集了癌干细胞的癌干细胞样耐药细胞株；
(2)佐剂的修饰：将泛素化蛋白募集蛋白偶联至佐剂，得偶联佐剂；
(3)募集泛素化蛋白：培养上述癌干细胞样耐药细胞株，抑制其泛素化蛋白降解，然后利用步骤(2)所得的偶联佐剂募集泛素化蛋白，即得所述癌干细胞样耐药细胞来源的泛素化蛋白。


2.根据权利要求1所述的癌干细胞样耐药细胞来源泛素化蛋白，其特征在于，步骤(1)中，所述癌细胞为乳腺癌细胞，所述化疗药选自烷化剂类、抗代谢性药物类、抗生素类、生物碱或紫杉醇类，优选抗生素类表阿霉素。


3.根据权利要求1所述的癌干细胞样耐药细胞来源泛素化蛋白，其特征在于，步骤(1)中，通过低浓度梯度递增联合大剂量间断冲击方法诱导癌细胞耐药，优选的方法如下：
培养癌细胞，待到细胞成长到55-85％时，换成含化疗药的培养基，从一开始(0.01-5)μg/ml的培养基含药浓度逐步递增到到(100-500)μg/ml，培养，每1～3天换液一次，传代。


4.根据权利要求1所述的癌干细胞样耐药细胞来源泛素化蛋白，其特征在于，步骤(2)中，所述泛...

【专利技术属性】
技术研发人员：王立新，黄芳，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32