通过适体-介导的多腺苷酸化信号可及性来调控基因表达制造技术

本发明专利技术提供用于通过基于适体调节一种或多种多腺苷酸化信号的可及性来调控基因表达的多核苷酸构建体，和使用所述构建体响应于结合适体的配体的存在或不存在来调控基因表达的方法。所述多核苷酸构建体含有核糖开关，所述核糖开关包含适体和效应物茎环，其中效应物茎环包含多腺苷酸化信号序列。

Regulation of gene expression through aptamer mediated polyadenylation signal accessibility

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通过适体-介导的多腺苷酸化信号可及性来调控基因表达专利
本专利技术提供用于通过基于适体调节一种或多种多腺苷酸化信号的可及性来调控基因表达的多核苷酸构建体，和使用所述多核苷酸构建体响应于结合适体的配体的存在或不存在来调控基因表达的方法。所述多核苷酸构建体含有核糖开关，所述核糖开关包含适体和效应物茎环，其中效应物茎环包含多腺苷酸化信号序列。专利技术背景真核细胞中的信使RNA(mRNA)通过广泛的转录后加工从前-mRNA转录物产生，包括5′末端帽化、通过剪接除去内含子以及3′末端裂解和多腺苷酸化。几乎所有的真核mRNA的3′末端包含多聚(A)尾—20-250个腺苷残基的均聚物。在细胞核中通过裂解和多腺苷酸化(通过大的蛋白复合物催化的过程)，多聚(A)尾被添加到前-mRNA。多聚(A)尾的添加依赖于多种元件的存在，包括多腺苷酸化位点上游存在的高度保守的AATAAA(或其变体ATTAAA)多腺苷酸化信号序列和其它上游元件(“USE”)，以及富含T或GT的下游元件(“DSE”)。多聚(A)尾添加到mRNA保护信息免于降解，以及其它功能。专利技术简述在一个方面，本专利技术提供用于调控靶基因表达的多核苷酸盒，所述多核苷酸盒包含核糖开关，其中核糖开关包含效应物茎-环和适体，其中效应物茎-环包含多腺苷酸化信号，和其中适体和效应物茎-环通过可替代共有茎臂连接，所述可替代共有茎臂包含与适体茎的非共有臂和效应物茎环的非共有臂互补的序列。在一个实施方案中，适体结合小分子配体。在实施方案中，与在适体茎中的序列和在效应物茎环中的序列互补的可替代共有茎臂的部分是4-8个核苷酸、5-7个核苷酸、5个核苷酸或6个核苷酸。在实施方案中，适体茎是6-12个碱基对、7-10个碱基对、8个碱基对或9个碱基对。在实施方案中，效应物茎环的茎是4-24个碱基对、5-20个碱基对、9-14个碱基对、9个碱基对、10个碱基对、11个碱基对或12个碱基对。在一个实施方案中，效应物茎-环位于适体的3′，使得可替代共有茎臂包含3′适体茎臂的全部或一部分和效应物茎的5′臂的全部或一部分。在一个实施方案中，效应物茎-环位于适体的5′，使得可替代共有茎臂包含5′适体茎臂的全部或一部分和效应物茎的3′臂的全部或一部分。在一个实施方案中，多腺苷酸化信号是AATAAA或ATTAAA。在一个实施方案中，多腺苷酸化信号是下游元件(DSE)。在一个实施方案中，多腺苷酸化信号是上游序列元件(USE)。在一个实施方案中，多核苷酸盒包含本专利技术的两个核糖开关，其中第一个核糖开关的效应物茎环包含多腺苷酸化信号AATAAA或ATTAA的全部或一部分，和第二个核糖开关的效应物茎环包含下游元件(DSE)的全部或一部分。在一个实施方案中，两个核糖开关各自包含结合相同配体的适体。在一个实施方案中，两个核糖开关包含结合不同配体的不同适体。在一个方面，本专利技术提供了调节靶基因表达的方法，所述方法包括：(a)将一个或多个本专利技术的多核苷酸盒插入靶基因的3′非翻译区中，(b)将包含多核苷酸盒的靶基因引入细胞中，和(c)将细胞暴露于有效增加靶基因的表达的量的结合适体的配体。在一个实施方案中，配体是小分子。在一个实施方案中，将两个核糖开关插入靶基因的3′非翻译区(“UTR”)中，其中第一个核糖开关的效应物茎环包含多腺苷酸化信号AATAAA或ATTAA的全部或一部分，和第二个核糖开关的效应物茎环包含下游元件(DSE)的全部或一部分。在一个实施方案中，两个核糖开关各自包含结合相同配体的适体。在一个实施方案中，两个核糖开关包含结合不同配体的不同适体。在一个实施方案中，两个或更多个多核苷酸盒包含相同的适体。在一个实施方案中，将包含多核苷酸盒的靶基因掺入用于表达靶基因的载体中。在一个实施方案中，载体为病毒载体。在一个实施方案中，病毒载体选自腺病毒载体、腺相关病毒载体和慢病毒载体。在一个方面，本专利技术提供包含含有本文所述的多核苷酸盒的靶基因的载体。在一个实施方案中，载体是病毒载体。在一个实施方案中，病毒载体选自腺病毒载体、腺相关病毒载体和慢病毒载体。在一个方面，本专利技术的多核苷酸盒与用于调控靶基因的表达的其它机制组合使用。在一个实施方案中，本专利技术的多核苷酸盒与基因调控盒组合使用，所述基因调控盒通过可变剪接的适体-介导的调控来调节靶基因表达，如WO2016/126747(PCT/US2016/016234)中所述，其通过引用并入本文。在其它实施方案中，本专利技术的多核苷酸盒与基因调控盒组合使用，所述基因调控盒通过自裂解核酶的适体-介导的调控来调节靶基因表达，如PCT/US2017/016303中所述，其通过引用并入本文。在其它实施方案中，本专利技术的多核苷酸盒与基因调控盒组合使用，所述基因调控盒通过多腺苷酸化的适体-介导的调节来调节靶基因表达，如PCT/US1207/016279中所述，其通过引用并入本文。附图简述图1a.本专利技术的一个实施方案的示意图，其中适体的3′茎臂通过可替代共有茎臂(即，可与适体茎或效应物茎形成茎结构，但不同时与二者形成茎结构的茎臂)连接至效应物茎-环的5′茎臂，和多腺苷酸化信号序列(在该情况下为AATAAA)位于效应物茎-环的茎中。图1b.本专利技术的一个实施方案的示意图，其中多腺苷酸化信号(在该情况下为AATAAA)的可及性通过存在或不存在适体配体来调控。连接至效应物茎-环(其中AATAAA序列在茎中嵌入)的适体插入在3′UTR中。茎-环结构的5′臂的互补序列(之后是适体序列)连接至茎-环结构的5′臂。在不存在适体配体时(上子图)，AATAAA序列被通过效应物茎-环形成的茎-环结构封锁，抑制多腺苷酸化，从而抑制基因表达。在存在适体配体时，适体/配体结合促进适体P1茎的形成，从而破坏效应物茎-环结构和导致AATAAA从隔离中释放。在茎-环结构的茎和适体P1茎之间共有的序列以粗线表示。图1c和图1d.通过AATAAA可及性的适体-介导的调节来调控萤光素酶表达。HEK293细胞用指示的构建体转染和用DMSO(图1c)或NaOH(图1d)作为溶剂对照或500μM鸟苷(图1c)或鸟嘌呤(图1d)处理。萤光素酶活性表示为平均值±S.D.(n=3)，和诱导倍数表示为在存在鸟苷或鸟嘌呤时获得的萤光素酶活性除以在不存在鸟苷或鸟嘌呤时获得的值的商。图1e.通过AATAAA可及性的适体-介导的调节来调控EGFP表达。HEK293细胞用指示的构建体转染和用NaOH作为溶剂对照或500μM鸟嘌呤处理。GFP荧光强度表示为平均值±S.D.(n=3)，和诱导倍数表示为在存在鸟嘌呤时获得的荧光强度除以在不存在鸟嘌呤时获得的值的商。图2a.通过适体/配体结合来调节茎-环中DSE的可及性的示意图。具有嵌入茎中的DSE序列的茎-环形成结构插入在3′UTR中。适体序列连接至茎-环形成结构的3′臂(之后是茎-环结构的3′臂的互补序列)。在不存在适体配体时(上子图)，DSE序列被茎-环结构的形成封锁，从而抑制多腺苷酸化和抑制靶基因表达。在存在适体配体时(下本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于调控靶基因的表达的多核苷酸盒，其包含核糖开关，其中所述核糖开关包含效应物茎环和适体，其中所述效应物茎包含多腺苷酸化信号，和其中所述适体和效应物茎环通过可替代共有茎臂连接，所述可替代共有茎臂包含与适体茎的非共有臂和效应物茎环的非共有臂互补的序列。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170221 US 62/4616891.用于调控靶基因的表达的多核苷酸盒，其包含核糖开关，其中所述核糖开关包含效应物茎环和适体，其中所述效应物茎包含多腺苷酸化信号，和其中所述适体和效应物茎环通过可替代共有茎臂连接，所述可替代共有茎臂包含与适体茎的非共有臂和效应物茎环的非共有臂互补的序列。


2.权利要求1的多核苷酸盒，其中所述适体结合小分子配体。


3.权利要求1的多核苷酸盒，其中与适体茎中的序列和效应物茎环中的序列互补的可替代共有茎臂的部分是4-8个核苷酸、5-7个核苷酸、5个核苷酸或6个核苷酸。


4.权利要求1的多核苷酸盒，其中所述适体茎是6-12个碱基对、7-10个碱基对、8个碱基对或9个碱基对。


5.权利要求1的多核苷酸盒，其中所述效应物茎环的茎是4-24个碱基对、5-20个碱基对、9-14个碱基对、9个碱基对、10个碱基对、11个碱基对或12个碱基对。


6.权利要求1-5的多核苷酸盒，其中所述效应物茎环位于适体的3′，使得可替代共有茎臂包含3′适体茎臂的全部或一部分和效应物茎的5′臂的全部或一部分。


7.权利要求6的多核苷酸盒，其中所述多腺苷酸化信号是AATAAA或ATTAAA。


8.权利要求1-5的多核苷酸盒，其中所述效应物茎环位于适体的5′，使得可替代共有茎臂包含5′适体茎臂的全部或一部分和效应物茎的3′臂的全部或一部分。


9.权利要求8的多核苷酸盒，其中所述多腺苷酸化信号是下游元件(DSE)。


10.权利要求1-5的包含两个核糖开关的多核苷酸盒，其中第一个核糖开关的效应物茎环包含多腺苷酸化信号AATAAA或ATTAAA的全部或一部分，和第二个核糖开关的效应物茎环包含下游元件(DSE)的全部或一部分。


11.权利要求10的多核苷酸盒，其中所述两个核糖开关各自包含结合相同配体的适体。


12.权利要求10的多核苷酸盒，其中所述两个核糖开关包含结合不同配体的不同适体。


13.一种调节靶基因的表达的方法，其包括：
a.将一个或多个权利要求1-5的多核苷酸盒插入靶基因的3′非翻译区中，
b.将包含多核苷酸盒的靶基因引入细胞中，和
c.将...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭雪翠，J韩，仲昭敬，
申请(专利权)人：梅里特斯英国第二有限公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB