CRYGD蛋白的应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，公开了CRYGD蛋白的应用及一种CRYGD蛋白的重组质粒。本发明专利技术所述CRYGD蛋白的重组质粒，为含有编码所述CRYGD蛋白核苷酸序列的基因载体转化宿主细胞后提取获得。CRYGD过表达质粒表达的CRYGD蛋白能够抑制视网膜祖细胞(RPC)及视网膜色素上皮细胞(RPE)的凋亡，可以作为视网膜祖细胞及视网膜色素上皮细胞凋亡的抑制剂，用于预防或治疗视网膜色素变性、黄斑变性、糖尿病视网膜病变等疾病。

Application of crygd protein

【技术实现步骤摘要】
CRYGD蛋白的应用
本专利技术属于生物
，具体涉及CRYGD蛋白的应用，尤其是涉及CRYGD蛋白在制备预防或治疗视网膜退行性病变的药物中的应用。
技术介绍
视网膜退行性病变(Retinaldegeneration)是由于视网膜细胞死亡引发的一系列眼睛疾病的统称，包括视网膜色素变性(RetinitisPigmentosa，RP)和年龄相关性黄斑变性(Age-relatedmaculardegeneration，ARMD)、糖尿病视网膜病变等疾病。其中视网膜色素变性是一组由于视网膜光感受器(视锥细胞和视杆细胞)退化及视网膜色素上皮变性为主要特征的进行性可致盲的遗传性视网膜疾病，世界范围内发病率约为1/3500。RP的临床特点主要有进行性视野缩小、夜盲、后极部或赤道部出现骨细胞样色素沉着、视神经乳头蜡黄、视网膜电流图(electrore-tinogram，ERG)显著异常或无波形等。因其发病机制主要为细胞凋亡，目前该类疾病尚无有效的预防和治疗方法，多年来各国科学家努力探索尝试各种方法治疗视网膜退行性病变，到目前为止方法有以下三种：(1)神经营养因子注射法。试验证明神经营养因子可以推迟或控制感光细胞的凋亡，从而达到治疗视网膜退行性病变的目的。但是，绝大多数的营养因子只有通过眼内注射起到治疗作用，而由于该方法不能长效供应营养，需要多次注射，易造成感染和视网膜脱离等并发症，其风险远远大于所获得的收益，所以该类方法仍需要进一步探索和研究。(2)细胞治疗方式。将细胞通过各种途径运输到眼内，通过细胞持续释放神经保护因子或细胞替代等方式治疗视网膜退行性病变。常用于治疗的细胞主要有：①胚胎干细胞(ES)：它具有分化成多种细胞的能力，但是这种细胞存在伦理、免疫排斥和畸胎瘤等问题，不适合临床应用；②多能诱导干细胞(iPS)：指将正常的成熟细胞在体外重编程为多能诱导干细胞，从理论上具有多向分化能力，但是它存在病毒整合和表达异常等问题；③间充质干细胞(MSC)：这种细胞具有有限的分化能力，取材方便，可以自体治疗，但是由于它有限的分化能力，因此在视网膜疾病治疗中的成功率并不高。(3)基因治疗方式：主要指利用病毒或非病毒载体将目的基因或功能基因转运到眼内，使载体遗传信息与受体遗传信息进行重新整合，从而从基因水平修复错配、突变等基因，达到治疗目的。基因治疗RP取得了较大的进展。研究发现能够引起视网膜感光细胞变性相关的基因有140余种，其中32个基因已被克隆。目前已建立了多种RP的动物模型，包括视网膜变性小鼠、慢性视网膜变性(retinaldegen-erationslow，rds)小鼠、皇家外科学院(RoyalCollegeofSurgeons，RCS)大鼠，为RP发病机制及治疗研究提供了帮助。与RP相关的基因所编码的蛋白质主要与光级酶联反应或视紫质光代谢、光感受器结构蛋白、光感受器细胞转录因子有关，目前研究表明RP病理变化均以细胞凋亡为共同途径。目前治疗Leber先天性黑矇(lebercongenitalamaurosis，LCA)的一期临床研究已经取得初步成功，这也为基因治疗RP带来了新的希望。Crystallingamma(CRYG)基因表达开始于最早的晶状体纤维细胞，在晶状体核中表达丰富，是晶状体核的主要构成部分，对晶状体的发育、细胞分化以及保持透明性有重要作用。Gamma晶状体蛋白有四个特征性的“Greek-key”基序。人类的gammacrystallin(crystallingamma)蛋白的编码基因包括一组只在晶状体表达的多基因家族成员，位于染色体2q33-q35，估计有7个密切相关基因家族成员CRYGA-CRYGF和小片段基因CRYGG。其中CRYGE和CRYGF是假基因，只有CRYGC和CRYGD编码丰富的蛋白质产物。CRYGD是gamma-crystallin(crystallingamma)的一个亚基，目前其生物学功能主要与视觉感知，细胞对氧活性的反应，晶状体纤维细胞的分化有关，未见CRYGD与视网膜色素变性相关的报道。
技术实现思路
申请人构建了人CRYGD表达载体以及视网膜祖细胞(RPC)及视网膜色素上皮细胞ARPE-19的H2O2诱导损伤模型，然后采用MTT检测不同处理组的细胞相对细胞活力，结果显示H2O2能够诱导视网膜祖细胞及ARPE-19人视网膜色素上皮的细胞氧化应激损伤，而转染CRYGD过表达质粒具有保护视网膜祖细胞和ARPE-19人视网膜色素上皮细胞的氧化应激损伤的作用。因此本专利技术提供了CRYGD蛋白在制备视网膜祖细胞或视网膜色素上皮细胞的凋亡抑制剂中的应用。尤其是在制备H2O2诱导的视网膜祖细胞或视网膜色素上皮细胞的凋亡抑制剂中的应用。目前研究表明，视网膜色素变性等视网膜退行性病变病理变化均以细胞凋亡为共同途径，因此抑制视网膜祖细胞或视网膜色素上皮细胞的凋亡可以有效改善视网膜色素变性病理变化。因此本专利技术提供了CRYGD蛋白在制备预防或治疗视网膜退行性病变的药物中的应用。其中，所述视网膜退行性病变包括视网膜色素变性、黄斑变性、糖尿病视网膜病变。作为优选，所述的CRYGD蛋白为含有编码所述CRYGD蛋白核苷酸序列的基因载体转化宿主细胞后表达获得。作为优选，所述编码所述的CRYGD蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。基因载体包括病毒载体和非病毒载体，病毒载体主要有腺相关病毒(adeno-associatedvirus，AAV)载体、慢病毒载体、腺病毒载体、重组腺相关病毒载体等。因为AAV载体其本身并不会被整合入人体基因组，而是作为循环载体，降低了引起其他基因病的风险，且只引起较小的免疫反应，并能在多种视网膜细胞中长期转基因表达，使其成为基因治疗眼部疾病的一个重要载体。病毒载体的缺点是所携带的基因大小有限，如AAV载体所携带的基因要小于4.7kb；非病毒载体对转移基因的大小没有限制，非病毒载体具备无传染性，没有载体容量限制，材料来源广泛，化学结构可控制，比病毒载体更安全，且易于大量制备，在表达质粒、反义寡核苷酸或反义表达质粒真核细胞的靶向转移中，有着病毒载体不可替代的作用。作为优选，所述基因载体为非病毒载体。在一些实施方案中，所述基因载体为真核表达载体pIRES2-EGFP。作为优选，所述宿主细胞可以为昆虫细胞、细菌、酵母或哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞为293T细胞。本专利技术还提供了一种CRYGD的重组质粒，含有编码所述CRYGD蛋白核苷酸序列的基因载体转化宿主细胞后提取获得。作为优选，所述重组质粒中所述编码所述的CRYGD蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。在一些实施方案中，所述重组质粒中所述基因载体为真核表达载体pIRES2-EGFP。作为优选，所述重组质粒中所述宿主细胞可以为昆虫细胞、细菌、酵母或哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述重组质粒中所述宿主细胞为293T细胞。由上述技术方案可知，本专利技术公开了CRYGD蛋白的应用及一种CRY本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.CRYGD蛋白在制备视网膜祖细胞及视网膜色素上皮细胞凋亡抑制剂中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.CRYGD蛋白在制备视网膜祖细胞及视网膜色素上皮细胞凋亡抑制剂中的应用。


2.CRYGD蛋白在制备预防或治疗视网膜退行性病变的药物中的应用。


3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述视网膜退行性病变包括视网膜色素变性、黄斑变性、糖尿病视网膜病变。


4.根据权利要求1-3任意一项所述的应用，其特征在于，所述的CRYGD蛋白为含有编码所述CRYGD蛋白核苷酸序列的基因载体转化宿主细胞后表达获得。


5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述编码所述的CRYGD蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。


6.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：王卓实，高飞，张明琦，张峰磊，
申请(专利权)人：何伟，
类型：发明
国别省市：辽宁;21