一种提高淡紫拟青霉孢子活力的液体深层发酵方法技术

本发明专利技术公开了一种提高淡紫拟青霉孢子活力的液体深层发酵方法，其是将淡紫拟青霉种子液接种于液体发酵培养基中进行发酵，发酵时间为36～48h，温度为26～28℃，发酵过程采用通气和溶氧两段控制法，在0～24h的菌体生长阶段，通气比为3:4～4:4 L/（L·min），并通过控制转速使发酵液的初始溶氧值为45～50%，促进菌丝的平稳生长，从24h到36～48h的孢子形成及成熟阶段，发酵液的溶氧值控制为5～10%，通气比为2:1～2.5:1 L/（L·min），促进产孢和孢子的成熟，提高活孢率；本发明专利技术方法解决了淡紫拟青霉液体发酵产出的孢子活孢率低的问题；能显著地提高孢子活孢率，36h后的活孢率在80%以上。

A method of liquid deep fermentation for improving spore activity of Paecilomyces lilacinus

【技术实现步骤摘要】
一种提高淡紫拟青霉孢子活力的液体深层发酵方法
本专利技术涉及一种提高淡紫拟青霉孢子活力的液体深层发酵方法，属于微生物发酵领域。
技术介绍
淡紫拟青霉隶属于半知菌亚门、丝孢钢、丝孢目、丛梗孢科、拟青霉属，在植物根结线虫病害治疗和防治效果方面表现突出，是目前市场上主要应用的菌株。淡紫拟青霉主要特征是分生孢子梗直立，瓶梗上常有2-4个轮状排列的个孢子梗，呈瓶状或近球形，分生孢子单孢串生，呈纺锤形或椭圆形，孢壁光滑或微粗糙，单个透明无色，成团时呈紫色。淡紫拟青霉（Paecilomyceslilacinus(Thom.)Samson）属于内寄生性真菌，能寄生多种植物寄生线虫。国内外研究表明：淡紫拟青霉能寄生的植物寄生线虫主要有根结线虫（Meloidogynespp）、胞囊线虫（Heteroderaspp）、甘薯茎线虫（Ditylenchusclestructor）、马铃薯金线虫（Globoderarostochiensis）等。目前，世界上许多线虫专家都在使用淡紫拟青霉来防治根结线虫、胞囊线虫等植物寄生线虫，而且取得了很好的防效。研究表明，淡紫拟青霉对大豆、小麦、棉花、黄麻、番莉、南瓜、茶苗、辣椒、菊花、葡萄、甘蔴、马铃薯、痴子、批橘、甘薯、烟草、花生、香蕉、疲萝、马铃薯、西瓜、甜瓜、番石播、罗汉果、称猴桃、黄瓜等作物的寄生线虫均有防治作用。自从1961年，捷克学者Sasinakova首次使用深层液体发酵生产白僵菌芽生孢子，从而引起了人们广泛的兴趣。虽然液体发酵技术在真菌产孢发酵上，具有条件易控、可重复性强、污染少、产量大、生产周期短等优点，但因其产出的孢子活孢率低影响孢子品质而不能广泛推广。目前国内外对淡紫拟青霉液体深层发酵产孢技术的控制条件研究较少，基于菌体生长阶段和孢子形成及成熟阶段不同的溶氧和通气需求，将其应用于发酵参数控制，以提高孢子的存活率，在此方面尚无报道。
技术实现思路
为了解决淡紫拟青霉液体发酵产出的孢子活孢率低的问题，本专利技术提供了一种提高淡紫拟青霉孢子活力的液体深层发酵方法；在液体深层发酵工艺控制上对发酵过程中的通气和溶氧采用分段控制，发酵初期，淡紫拟青霉处于菌丝生长阶段，此时生物量低需氧量少所以采用低通气量和45～50%的较高溶氧来促进菌丝平稳增长，随着发酵进行溶氧下降至15%左右，低氧胁迫开始形成，淡紫拟青霉进入产孢阶段，为了满足产孢和孢子成熟的溶氧需求，因此提供高通气增强菌的获氧量，同时为了不打破低氧胁迫的环境因素，因此维持溶氧在5～10%，从而在促进产孢和孢子成熟过程中也提高了孢子的活孢率；该方法生产的淡紫拟青霉孢子能够用于农作物根结线虫病害的防治，也可以作为微生物肥料用于改善植物生长。本专利技术方法包括以下具体步骤：A、菌种平板的制备将淡紫拟青霉菌种接种于PDA固体培养基上，放入28℃培养箱中培养3～5天，待菌丝长满平板产孢即可；B、液体摇瓶种子培养将三角锥形瓶中装入液体培养基，用121℃高压灭菌20min，待冷却至室温后，用打孔器打取菌块接入液体培养基中，并置于恒温培养箱中28℃、200r/min条件下培养24h～30h，获得淡紫拟青霉种子液；C、发酵罐发酵在发酵罐中装入液体培养基，用121℃高压灭菌20min后，冷却至26～28℃，将淡紫拟青霉种子液接种于发酵罐中，26～28℃下进行液体深层发酵36～48h，发酵完成后收获孢子；上述液体深层发酵过程中采用通气和溶氧两段控制法，在0～24h的菌体生长阶段，通气比为3:4～4:4L/（L·min），并通过控制转速使发酵液的初始溶氧值为较高的45～50%，促进菌丝平稳增长；随着发酵延续，溶氧量降至15%左右而开始进入产孢期，从24h到36～48h的孢子形成及成熟阶段，发酵液的溶氧值控制为5～10%，通气比为2:1～2.5:1L/（L·min），促进产孢和孢子的成熟，提高活孢率。本专利技术方法具有如下特点：在发酵工艺控制上通气和溶氧采用两段控制，发酵初期，淡紫拟青霉处于菌丝生长阶段，此时生物量低需氧量少所以采用低通气量和45～50%的较高溶氧来促进菌丝平稳增长，随着溶氧下降至15%左右，低氧胁迫开始形成，淡紫拟青霉进入产孢阶段，为了满足产孢和孢子成熟的溶氧需求因此提供高通气增强菌的获氧量，同时为了不打破低氧胁迫的环境因此维持溶氧在5～10%，从而在促进产孢和孢子成熟过程中也提高了孢子的活孢率；本专利技术方法简单易行，获得的孢子成活率高，适于工业化生产和市场推广应用。附图说明图1为实施例1中发酵参数控制图；图2为实施例1中发酵过程通气量控制图；图3为本专利技术工艺和其他控制工艺活菌数结果对比图；图4为本专利技术工艺和其他控制工艺活孢率结果对比图；图5为未被侵染的正常虫卵；图6为淡紫拟青霉菌丝侵染进入虫卵；图7为淡紫拟青霉菌丝从虫卵中伸出图；图8为淡紫拟青霉侵染的虫卵解体示意图。具体实施方式下面通过实施例对本专利技术的技术方案作进一步详细说明，但本专利技术的内容并不局限于此，本实施例中方法如无特殊说明均为常规方法，所用材料、试剂等如无特殊说明均从商业途径得到。实施例1：本提高淡紫拟青霉孢子活力的液体深层发酵方法如下：（1）菌种平板的制备取削皮后的马铃薯100g用500mL的水煮沸20min，取汁液，在汁液中添加10g葡萄糖、10g琼脂和水制得500mL溶液，调节pH为6.8-7.0，装入2L三角锥形瓶内，灭菌后倒平板；然后将淡紫拟青霉菌种接种于PDA平板上，放入28℃培养箱中培养5天，待菌丝长满平板产孢即可；（2）液体摇瓶种子培养将500mL三角锥形瓶中装入100mL液体培养基，用121℃高压灭菌20min，待冷却至室温后，用打孔器打取菌块接入液体培养基中，并置于恒温培养箱中28℃、200r/min条件下培养25h，获得淡紫拟青霉种子液；其中液体培养基配方为：在50mL培养基中含2.25g葡萄糖、1g大豆粉、0.1g磷酸二氢钾、0.015g无水氯化钙、0.015g七水合硫酸镁、0.00185g六水合氯化钴、0.0025g七水合硫酸铁、0.0008g一水合硫酸锰、0.0007g七水合硫酸锌；（3）发酵罐发酵在5L发酵罐中装入2L液体培养基，用121℃高压灭菌20min后，冷却至28℃，将淡紫拟青霉种子液按1.5%（v/v）的比例接种于发酵罐中，发酵罐发酵控制参数为温度控制为28℃，通气和溶氧采用两段控制，0-24h为菌体生长阶段，初始溶氧值为48%，通气比为1:1L/（L·min），24-48h为孢子形成及成熟阶段，溶氧维持为5%，通气比为2.5:1L/（L·min）；发酵各参数控制见图1、2，通过约48小时的发酵，收获孢子；发酵罐中液体培养基的配方为：45g/L蔗糖、20g/L大豆粉、2g/L磷酸二氢钾、0.3g/L无水氯化钙、0.3g/L七水合硫酸镁、0.037g/L六水合氯化钴、0.05g/L七水合硫酸铁、0.0本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高淡紫拟青霉孢子活力的液体深层发酵方法，其特征在于：将淡紫拟青霉种子液接种于液体发酵培养基中进行发酵，发酵时间为36～48h，温度为26～28℃，发酵过程采用通气和溶氧两段控制法，在0～24h的菌体生长阶段，通气比为3:4～4:4 L/（L·min），并通过控制转速使发酵液的溶氧值为45～50%，促进菌丝平稳生长，从24h到36～48h的孢子形成及成熟阶段，发酵液的溶氧值控制在5～10%，通气比为2:1～2.5:1 L/（L·min），促进产孢和孢子的成熟，提高活孢率。/n

【技术特征摘要】
1.一种提高淡紫拟青霉孢子活力的液体深层发酵方法，其特征在于：将淡紫拟青霉种子液接种于液体发酵培养基中进行发酵，发酵时间为36～48h，温度为26～28℃，发酵过程采用通气和溶氧两段控制法，在0～24h的菌体生长阶段，通气比为3:4～4:4...

【专利技术属性】
技术研发人员：林连兵，杨佳林，邓先余，张棋麟，王峰，郭军，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：云南;53