咪鲜胺半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了咪鲜胺半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用，本发明专利技术提供的咪鲜胺半抗原既最大程度保留了咪鲜胺的特征结构，使得咪鲜胺半抗原的免疫原性明显增强，又具有可以与载体蛋白发生偶联的羧基；用咪鲜胺半抗原与载体蛋白偶联后得到的咪鲜胺免疫抗原去免疫动物，更有利于刺激动物免疫应答产生特异性更强、灵敏度更高的抗体，经检测咪鲜胺抗体的灵敏度可达0.1μg/L，与其他农药的交叉反应率低，为后续建立咪鲜胺的各种免疫分析方法提供了基础。

Prochloraz hapten, artificial antigen and antibody and their preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
咪鲜胺半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用
本专利技术属于食品安全检测领域。更具体地，本专利技术涉及咪鲜胺半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用。
技术介绍
咪鲜胺(Prochloraz)是一种广谱杀菌剂，对大田作物、水果蔬菜、草皮及观赏植物上的多种病害具有防治作用；另外，咪鲜胺还可用于柑橘、香蕉等水果收获后的产品保鲜，其应用范围较为广泛。有关咪鲜胺的用量各国都有严格的规定，如CAC、欧盟和日本都规定了咪鲜胺在生乳中的MRL值，分别为0.05、0.4、0.05mg/kg，我国国家标准GB2763-2016《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》中也规定了不同食品中咪鲜胺的残留限量。目前，国内外检测咪鲜胺主要有气相色谱法、高效液相色谱法和液相色谱质谱法等分析方法。仪器检测法存在样品前处理繁琐、检测时间长、仪器贵重等缺点，所以在我国无法得到广泛应用，并且不符合现场检测“在短时间内低成本对大量样品进行准确检测和筛选”的要求。而免疫学检测分析技术以其高灵敏、特异性高、快速、操作简便等优点在药物残留检测领域已被广泛应用，比起仪器等检验方法有很多优势。所以免疫分析为咪鲜胺残留研究提供了一条新的分析检测方法。在建立免疫学检测方法并应用该检测方法检测咪鲜胺残留量时，关键技术在于能够获取到特异性强、灵敏度高的抗体，而要实现这一目标，前提条件就是得合成、制备出合适的咪鲜胺半抗原。但是，目前国内还没有针对咪鲜胺半抗原的相关报道。
技术实现思路
针对现有技术中存在的不足之处，本专利技术提供一种能最大程度保留咪鲜胺的特征结构，又具有一定长度连接臂的半抗原以及这种半抗原的制备方法；以此半抗原制备的人工抗原、检测灵敏度高和特异性强的抗体；以及此半抗原的应用。本专利技术所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：本专利技术的第一个目的是提供一种咪鲜胺半抗原，其具有如下结构式：本专利技术的第二个目的是提供一种咪鲜胺半抗原的制备方法，其包括如下步骤：1)3-(3-羟基-2,4,6-三氯)-丙酸与1,2-二氯乙烷发生反应，得到中间体1，所述中间体1具有结构式2)将所述中间体1与正丙胺发生反应，得到中间体2，所述中间体2具有结构式3)将所述中间体2与二(三氯甲基)碳酸酯、咪唑发生反应，得到咪鲜胺半抗原。进一步地，所述步骤1)包括如下步骤：取3-(3-羟基-2,4,6-三氯)-丙酸2.69g加1,2-二氯乙烷60mL溶解，加入KOH0.57g，60℃反应6h，停止反应，加水洗涤，蒸干得到中间体1。进一步地，所述步骤2)包括如下步骤：在中间体1中加入正丙胺40mL、无水碘化钠0.31g、碳酸钾1.38g，加热回流反应4h，停止反应，旋蒸，除去正丙胺，加水震荡，用乙酸乙酯萃取，收集有机相，有机相用正己烷-二氯甲烷重结晶，得到中间体2。进一步地，所述步骤3)包括如下步骤：取中间体21.2g加二氯甲烷80mL溶解，加入二(三氯甲基)碳酸酯1.1g和三乙胺0.3mL，室温搅拌3h，加入咪唑0.27g，继续搅拌7h，停止反应，加水萃取洗涤，蒸干，得到红色油状物，上硅胶柱，石油醚-乙酸乙酯洗脱分离纯化，得到咪鲜胺半抗原。本专利技术的第三个目的是提供一种咪鲜胺人工抗原，其是载体蛋白和上述咪鲜胺半抗原偶联得到的偶联物。进一步地，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白或血蓝蛋白。本专利技术的第四个目的是提供一种咪鲜胺人工抗原的制备方法，包括如下步骤：将上述咪鲜胺半抗原溶于有机溶剂中，加入碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，充分混匀后，反应4h，即为A液，其中所述咪鲜胺半抗原、碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的物质的量之比为1:(2-3):(2-3)；将载体蛋白溶解在0.05mol/L的PB缓冲液中，得到B液；以及将所述A液滴加到所述B液中，4℃反应24h，纯化后得到所述咪鲜胺人工抗原。本专利技术的第五个目的是提供一种咪鲜胺抗体，它是由上述咪鲜胺人工抗原经动物免疫得到，其能与咪鲜胺发生特异性免疫反应。进一步地，所述咪鲜胺抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。本专利技术的第六个目的是提供上述咪鲜胺抗体在检测咪鲜胺残留中的应用。本专利技术具有如下有益效果：本专利技术提供的咪鲜胺半抗原既最大程度保留了咪鲜胺的特征结构，使得咪鲜胺半抗原的免疫原性明显增强，又具有可以与载体蛋白发生偶联的羧基；用咪鲜胺半抗原与载体蛋白偶联后得到的咪鲜胺人工抗原去免疫动物，更有利于刺激动物免疫应答产生特异性更强、灵敏度更高的抗体，为后续建立咪鲜胺的各种免疫分析方法提供基础。本专利技术中咪鲜胺半抗原的制备方法，使用的原料易得，反应操作较为简单，反应条件易于控制，制备的咪鲜胺半抗原的纯度和收率较高。采用本专利技术的咪鲜胺人工抗原得到的咪鲜胺抗体的效价、特异性、亲和力都较好，灵敏度可达到0.1μg/L，与其他农药的交叉反应率低。附图说明图1是本专利技术咪鲜胺半抗原的合成路线具体实施方式第一方面，本专利技术提供一种咪鲜胺半抗原，其具有如下结构式：本专利技术提供的咪鲜胺半抗原既最大程度保留了咪鲜胺的特征结构，使得咪鲜胺半抗原的免疫原性明显增强，又具有可以与载体蛋白发生偶联的羧基；用咪鲜胺半抗原与载体蛋白偶联后得到的咪鲜胺人工抗原去免疫动物，更有利于刺激动物免疫应答产生特异性更强、灵敏度更高的抗体。本专利技术的咪鲜胺半抗原弥补了国内咪鲜胺免疫学检测方法
的空白，为咪鲜胺免疫检测方法的进一步发展奠定了基础。第二方面，本专利技术提供上述咪鲜胺半抗原的制备方法，其包括如下步骤：1)3-(3-羟基-2,4,6-三氯)-丙酸与1,2-二氯乙烷发生反应，得到中间体1，所述中间体1具有结构式2)将所述中间体1与正丙胺发生反应，得到中间体2，所述中间体2具有结构式3)将所述中间体2与二(三氯甲基)碳酸酯、咪唑发生反应，得到咪鲜胺半抗原。优选地，所述步骤1)包括如下步骤：取3-(3-羟基-2,4,6-三氯)-丙酸2.69g加1,2-二氯乙烷60mL溶解，加入KOH0.57g，60℃反应6h，停止反应，加水洗涤，蒸干得到中间体1。优选地，所述步骤2)包括如下步骤：在中间体1中加入正丙胺40mL、无水碘化钠0.31g、碳酸钾1.38g，加热回流反应4h，停止反应，旋蒸，除去正丙胺，加水震荡，用乙酸乙酯萃取，收集有机相，有机相用正己烷-二氯甲烷重结晶，得到中间体2。优选地，所述步骤3)包括如下步骤：取中间体21.2g加二氯甲烷80mL溶解，加入二(三氯甲基)碳酸酯1.1g和三乙胺0.3mL，室温搅拌3h，加入咪唑0.27g，继续搅拌7h，停止反应，加水萃取洗涤，蒸干，得到红色油状物，上硅胶柱，石油醚-乙酸乙酯洗脱分离纯化，得到咪鲜胺半抗原。半抗原的制备方法主要包括：(1)利用待测物现有结构或中间体，通过氧化、还原、取代、水解等反应产生相应的功能基团；(2)利用其代谢产物或结构类似物作本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种咪鲜胺半抗原，其特征在于，其具有如下结构式：/n

【技术特征摘要】
1.一种咪鲜胺半抗原，其特征在于，其具有如下结构式：





2.如权利要求1所述的咪鲜胺半抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)3-(3-羟基-2,4,6-三氯)-丙酸与1,2-二氯乙烷发生反应，得到中间体1，所述中间体1具有结构式
2)将所述中间体1与正丙胺发生反应，得到中间体2，所述中间体2具有结构式
3)将所述中间体2与二(三氯甲基)碳酸酯、咪唑发生反应，得到咪鲜胺半抗原。


3.如权利要求2所述的咪鲜胺半抗原的制备方法，其特征在于，所述步骤1)包括如下步骤：取3-(3-羟基-2,4,6-三氯)-丙酸2.69g加1,2-二氯乙烷60mL溶解，加入KOH0.57g，60℃反应6h，停止反应，加水洗涤，蒸干得到中间体1。


4.如权利要求2所述的咪鲜胺半抗原的制备方法，其特征在于，所述步骤2)包括如下步骤：在中间体1中加入正丙胺40mL、无水碘化钠0.31g、碳酸钾1.38g，加热回流反应4h，停止反应，旋蒸，除去正丙胺，加水震荡，用乙酸乙酯萃取，收集有机相，有机相用正己烷-二氯甲烷重结晶，得到中间体2。


5.如权利要求2所述的咪鲜胺半抗原的制备方法，其特征在于，所述步骤3)包括如下步骤：取中间体21.2g加二...

【专利技术属性】
技术研发人员：万宇平，崔廷婷，崔海峰，张瑜，何方洋，马玉华，崔娜，赵正苗，
申请(专利权)人：北京勤邦生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11