一种液体饮料中β-羟基-β-甲基丁酸及其钙盐的测定和确证方法技术

本发明专利技术公开了一种液体饮料中β‑羟基‑β‑甲基丁酸及其钙盐的测定和确证方法。该方法采用高效液相色谱‑串联质谱对液体饮料中β‑羟基‑β‑甲基丁酸进行测定和确证；通过换算系数和已测定的β‑羟基‑β‑甲基丁酸含量，换算得到液体饮料中β‑羟基‑β‑甲基丁酸钙盐的含量。该方法包括液体饮料中β‑羟基‑β‑甲基丁酸测定的样品前处理步骤，空白试验方法，高效液相色谱‑串联质谱的测定和确证步骤，以及液体饮料中β‑羟基‑β‑甲基丁酸钙盐的换算方法。本发明专利技术提供的液体饮料中β‑羟基‑β‑甲基丁酸及其钙盐的测定和确证方法，具有色谱保留和线性关系好、样品前处理较简单、回收率和准确度高等优点，可广泛应用于液体饮料样品中β‑羟基‑β‑甲基丁酸及其钙盐成分的定量检测和掺假判别。

Determination and confirmation of \u03b2 - hydroxy - \u03b2 - methylbutyric acid and its calcium salt in liquid beverage

【技术实现步骤摘要】
一种液体饮料中β-羟基-β-甲基丁酸及其钙盐的测定和确证方法
本专利技术涉及食品和保健品质量分析领域，尤其涉及一种液体饮料中β-羟基-β-甲基丁酸及其钙盐的测定和确证方法。
技术介绍
β-羟基-β-甲基丁酸(CAS:625-08-1)是必需氨基酸亮氨酸在体内通过其代谢产物α-酮异己酸产生的一种衍生物。必需氨基酸亮氨酸无法在人体内自行合成，一般通过饮食从外界摄取，人体内的亮氨酸除了被用于蛋白合成外，少量的亮氨酸经代谢后能产生少量的β-羟基-β-甲基丁酸，在正常饮食条件下，成年人体一般每天能产生约200～400mgβ-羟基-β-甲基丁酸。由于β-羟基-β-甲基丁酸对人体具有增加肌肉合成，减少肌肉分解，减少脂肪，增长瘦体重，改善肌肉质量、肌肉力量和躯体功能的作用，并可以用于肌少症的营养干预，近年来备受众多医学专家和营养专家的关注，以及健身职业运动员的青睐。在商业化生产中，为了便于储存和使用，合成时通常将β-羟基-β-甲基丁酸转化成β-羟基-β-甲基丁酸钙盐的形式，β-羟基-β-甲基丁酸钙为粉末状物质，溶于水，并且稳定性较好。原卫生部2011年1号公告批准β-羟基-β-甲基丁酸钙作为新资源食品，使用范围为运动营养食品、特殊医学用途配方食品；2017年5月国家卫生计生委发布公告，由于β-羟基-β-甲基丁酸钙的安全性评估材料审查并通过，故扩大β-羟基-β-甲基丁酸钙的使用范围到液体饮料类、乳及乳制品、可可制品、巧克力和巧克力制品以及糖果、烘焙食品。随着使用范围的大幅扩增，β-羟基-β-甲基丁酸及其钙盐在包括液体饮料在内的多种产品中，将具有十分广阔的应用前景。当前，国内外有关食品中β-羟基-β-甲基丁酸及其钙盐的检测，未见液体饮料中β-羟基-β-甲基丁酸及其钙盐含量的检测方法，但已有液相色谱紫外法(HPLC-UV)检测大豆肽蛋白质粉中β-羟基-β-甲基丁酸的含量的报道。由于单纯的HPLC-UV检测法是一种非确证检测方法，无法对目标化合物进行定性确证，进而影响样品检测结果是否含有β-羟基-β-甲基丁酸的确证判断。本专利技术旨在建立一种液体饮料中β-羟基-β-甲基丁酸及其钙盐的高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)测定和确证方法，考虑到已有的大豆肽蛋白质粉样品检测所用的HPLC-UV法中的磷酸盐流动相体系和质谱不兼容，以及液体饮料中β-羟基-β-甲基丁酸及其钙盐含量的检测未见报道的现状，本专利技术通过优化色谱柱类型、与质谱兼容的流动相，以及样品前处理方法等，建立一种液体饮料中β-羟基-β-甲基丁酸及其钙盐的高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)测定和确证方法。所建立的方法在灵敏度、抗干扰能力以及目标化合物的确证方面具有明显的优势，并且具有色谱保留和线性关系好、样品前处理较简单、回收率和准确度高等优点，可广泛应用于液体饮料样品中β-羟基-β-甲基丁酸及其钙盐成分的定量检测和掺假判别。
技术实现思路
为了解决液体饮料中β-羟基-β-甲基丁酸及其钙盐无对应的测定和确证方法的难题，本专利技术的目的是提供一种液体饮料中β-羟基-β-甲基丁酸及其钙盐的测定和确证方法，该方法具有色谱保留和线性关系好、样品前处理较简单、回收率和准确度高，能定性确证等优点。为了实现上述目的，本专利技术提供一种液体饮料中β-羟基-β-甲基丁酸及其钙盐的测定和确证方法，包括以下步骤：(1)对不含和含二氧化碳液体饮料样品的前处理；(2)空白试验：除未添加液体饮料样品外，其他均按照步骤(1)方法处理后得到的样品；(3)高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)测定和确证β-羟基-β-甲基丁酸；(4)液体饮料中β-羟基-β-甲基丁酸钙盐含量的换算。作为进一步的改进，步骤(1)中，不含二氧化碳液体饮料样品的前处理步骤为：称取1～5g均匀试样至50mL容量瓶中，添加约25mL0.1％甲酸甲醇溶液混匀后，超声提取10min，冷却至室温后用0.1％甲酸甲醇溶液定容至刻度混匀。将容量瓶中适量液体转移至塑料离心管中，以≥10000rpm的速度离心5min，将上清液转移至进样瓶中，待测。如上清液中的β-羟基-β-甲基丁酸浓度过大，并超校准曲线范围，应按照逐级稀释的原则，将上清液用0.1％甲酸甲醇溶液稀释后再进行测定。作为进一步的改进，步骤(1)中，含二氧化碳液体饮料样品的前处理步骤为：转移适量液体试样至烧杯中，置于超声波清洗器中超声，直至烧杯中液体试样无气泡冒出，取出烧杯冷却至室温。称取1～5g均匀试样至50mL容量瓶中，添加约25mL0.1％甲酸甲醇溶液混匀后，超声提取10min，冷却至室温后用0.1％甲酸甲醇溶液定容至刻度混匀。将容量瓶中适量液体转移至塑料离心管中，以≥10000rpm的速度离心5min，将上清液转移至进样瓶中，待测。如上清液中的β-羟基-β-甲基丁酸浓度过大，并超校准曲线范围，应按照逐级稀释的原则，将上清液用0.1％甲酸甲醇溶液稀释后再进行测定。作为进一步的改进，步骤(3)中，高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)测定β-羟基-β-甲基丁酸的条件见表1。表1β-羟基-β-甲基丁酸在多反应监测模式下的母离子、子离子、碰撞能和去簇电压参数见表2。表2作为进一步的改进，步骤(3)中，高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)确证β-羟基-β-甲基丁酸的方法如下：按照高效液相色谱-质谱条件对标准工作溶液和样液进行测定，如样液中的色谱峰保留时间与标准工作溶液一致，样液中目标化合物所选择的离子均出现，而且选择的离子丰度比与标准工作溶液的丰度比在表3允许偏差范围内，则可判断样液中存在β-羟基-β-甲基丁酸。表3相对离子丰度>50％20％～50％10％～20％≤10％允许的相对偏差±20％±25％±30％±50％作为进一步的改进，步骤(4)中，液体饮料中β-羟基-β-甲基丁酸钙盐含量的换算方法如下：根据液体饮料中β-羟基-β-甲基丁酸的测定结果，将试样中测得的β-羟基-β-甲基丁酸含量乘以对应的换算系数，可换算得到液体饮料中β-羟基-β-甲基丁酸钙盐或水合β-羟基-β-甲基丁酸钙盐的含量。作为进一步的改进，步骤(4)中，液体饮料中β-羟基-β-甲基丁酸钙盐含量的换算方法，β-羟基-β-甲基丁酸钙的换算系数为1.16。作为进一步的改进，步骤(4)中，液体饮料中β-羟基-β-甲基丁酸钙盐含量的换算方法，一水合β-羟基-β-甲基丁酸钙的换算系数为2.24。当称样量为5g时，本方法对β-羟基-β-甲基丁酸(CAS：625-08-1)、β-羟基-β-甲基丁酸钙、一水合β-羟基-β-甲基丁酸钙的定量限见表4。表4中文名称分子量定量限(μg/kg)β-羟基-β-甲基丁酸1183本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种液体饮料中β-羟基-β-甲基丁酸及其钙盐的测定和确证方法，其特征在于该检测方法包括以下的步骤：/n(1)对不含和含二氧化碳液体饮料样品的前处理；/n(2)空白试验：除未添加液体饮料样品外，其他均按照步骤(1)方法处理后得到的样品；/n(3)高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)测定和确证β-羟基-β-甲基丁酸；/n(4)液体饮料中β-羟基-β-甲基丁酸钙盐含量的换算。/n

【技术特征摘要】
1.一种液体饮料中β-羟基-β-甲基丁酸及其钙盐的测定和确证方法，其特征在于该检测方法包括以下的步骤：
(1)对不含和含二氧化碳液体饮料样品的前处理；
(2)空白试验：除未添加液体饮料样品外，其他均按照步骤(1)方法处理后得到的样品；
(3)高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)测定和确证β-羟基-β-甲基丁酸；
(4)液体饮料中β-羟基-β-甲基丁酸钙盐含量的换算。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，不含二氧化碳液体饮料样品的前处理步骤为：称取1～5g均匀试样至50mL容量瓶中，添加约25mL0.1％甲酸甲醇溶液混匀后，超声提取10min，冷却至室温后用0.1％甲酸甲醇溶液定容至刻度混匀。将容量瓶中适量液体转移至塑料离心管中，以≥10000rpm的速度离心5min，将上清液转移至进样瓶中，待测。如上清液中的β-羟基-β-甲基丁酸浓度过大，并超校准曲线范围，应按照逐级稀释的原则，将上清液用0.1％甲酸甲醇溶液稀释后再进行测定。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，含二氧化碳液体饮料样品的前处理步骤为：转移适量液体试样至烧杯中，置于超声波清洗器中超声，直至烧杯中液体试样无气泡冒出，取出烧杯冷却至室温。称取1～5g均匀试样至50mL容量瓶中，添加约25mL0.1％甲酸甲醇溶液混匀后，超声提取10min，冷却至室温后用0.1％甲酸甲醇溶液定容至刻度混匀。将容量瓶中适量液体转移至塑料离心管中，以≥10000rpm的速度离心5min，将上清液转移至进样瓶中，待测。如上清液中的β-羟基-β-甲基丁酸浓度过大，并超校准曲线范围，应按照逐级稀释的原则，将上清液用0.1％甲酸甲醇溶液稀释后再进行测定。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)测定β-羟基-β-甲基丁酸的条件如下：
色谱柱：极性端基封尾的C18固定相色谱柱(SynergyHydro-RP色谱柱，250×4.6mm，4μm)或相当者；
梯度洗脱：流动相A为0...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘萍，
申请(专利权)人：台州科技职业学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33