一种中和肠道病毒71型的全人源单克隆抗体及其用途制造技术

本发明专利技术属于生物免疫学领域，更具体地，涉及一种中和肠道病毒71型的全人源单克隆抗体及其用途，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:14‑20任一项所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:21‑26任一项所示。本发明专利技术还提供编码该抗体的核酸分子、表达载体、用途和组合物。本发明专利技术的结合分子能阻止EV71型病毒侵染易感细胞，且是全人源的，与其它动物源性(如鼠源性)抗EV71型病毒的分子相比，免疫原性低，且亲和性良好，不仅治疗效果好，而且副作用低。

An all human monoclonal antibody for neutralizing enterovirus 71 and its application

【技术实现步骤摘要】
一种中和肠道病毒71型的全人源单克隆抗体及其用途
本专利技术涉及生物免疫学领域，具体地说，涉及一种中和肠道病毒71型的全人源单克隆抗体及其用途。
技术介绍
手足口病(Handfootmouthdisease，HFMD)是由肠道病毒引起的一种常见的婴幼儿急性传染病，发病年龄多为4岁以下，表现为口痛、厌食、低热及手、足、口腔等部位出现小疱疹或小溃疡，多数患儿1周左右自愈，少数患儿可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜炎等并发症，重症患儿病情发展快可导致死亡，目前缺乏有效治疗药物。近几十年来，HFMD已在全世界多个地区爆发和流行，在2008年我国将手足口病列入法定报告管理的丙类传染病，要求在24h之内上报卫生部。2009-2015年，我国卫生部门共收到1300多万手足口病病例报告，死亡3216人，平均每年有400-500例儿童因此死亡。手足口病的发病人数和病死人数占我国丙类传染病的首位。引起手足口病症状的病毒主要以肠道病毒71型(enterovirus71，EV71)和柯萨奇病毒A组16型(coxsachievirusA16，CoxA16)最为常见，其中重症病例的80％以上、死亡病例的90％以上都是EV71型感染所致。EV71型病毒除了引起HFMD以外，更易合并严重并发症。肠道病毒EV71有明显的季节性，多在夏秋季节流行，人是其敏感宿主，除少数灵长动物外，没有其他宿主。EV71是小单链正义RNA病毒，属于肠道病毒属小RNA病毒科，分子量为2.6×106D，约含7400个核苷酸。EV71毒粒为二十面体形，立体对称，呈球形状，是裸露的核衣壳，直径约为23-30nm，无包膜。EV7的衣壳蛋白由VP1、VP2、VP3和VP4组成。VP1、VP2和VP3裸露于病毒颗粒的表面，VP4位于病毒颗粒衣壳的内表面与RNA核心紧密相连。根据病毒衣壳蛋白VP1或内部蛋白VP4核苷酸序列的不同，可将EV71分为A、B、C、D四个基因型，其中B型分为B1-B5亚型，C型分为C1-C5亚型，不同亚型感染后临床症状不完全相同。从1998年至今在中国多个地区分离的EV71病毒都有较高的同源性，均属于C4亚型，基因型变化较小。VP1蛋白暴露于毒粒表面，且病毒的主要抗原决定簇位于VP1上，它具有良好的抗原性和免疫原性，是诱导机体产生EV71特异性抗体的有效抗原。从1992年首个抗体药物Orthoclone上市以来，到2016年底共上市了63个抗体药物，平均每年上市2.5个抗体药物，且速度越来越快。抗体药物用于病毒感染性疾病的治疗早有报道，抗血清用于治疗SARS和重症H5N1丙型肝炎病毒感染者的案例已经证明了抗体在治疗病毒感染中发挥的重要作用。具有中和活性的抗肠道病毒71型的全人源单克隆抗体具有以下潜在优势：一方面它可以阻断病毒与靶细胞的结合；另一方面通过补体和T细胞、NK细胞等效应细胞的作用，将被病毒感染的细胞杀死。我们通过采集EV71型手足口病毒感染者抗凝全血，体外分离活化记忆性B细胞，促使其分泌抗体，筛选出阳性B细胞克隆，并提取阳性B细胞的RNA，从中扩增抗体重链和轻链基因并克隆到表达载体中，再用携带重链基因的质粒和携带轻链基因的质粒共转染HEK293T细胞，ELISA筛选出具有VP1抗原特异性的抗体重组质粒，再进行抗体序列分析和抗体蛋白的表达纯化，最后，进一步利用中和效应实验筛选出具有病毒中和效应的抗体。2016年上半年针对EV71病毒的疫苗已经获批上市，这是目前唯一可用于预防手足口病的疫苗，能在一定程度上遏制EV71病毒所致的手足口病发病率，但也存在部分局限性：5岁以上的人、发热、急慢性疾病期发作患者及过敏体质者都不得接种该疫苗；对疫苗中心活性物质以及硫酸卡那霉素过敏者也不能接种；疫苗接种具有个体差异性，可以会有一些不良反应；不能防止EV71病毒所有的基因亚型，对已经感染EV71病毒的患者无效。目前临床尚无直接靶向EV71病毒的药物，主要采取对症治疗的策略。在治疗病毒感染时，临床上一线药物普遍使用的是类似于利巴韦林、阿昔洛韦等广谱的抗病毒药物，并可以联合清开灵、双黄连等中药使用，起到了抗病毒的功效。但是利巴韦林等核苷类似物药物易诱发溶血性贫血等不良反应，对婴幼儿生长发育具有一定潜在的抑制作用，用于治疗时需慎重权衡获益与风险。使用的中药虽然都有清热解毒的功效,但也都属于广谱的清热解毒药物,针对性不强，其直接作用机制还不明确。综上所述，目前缺乏特效的、专一的、机制明确的抗EV71药物，因此研制针对EV71病毒高特异性的全人源单克隆抗体具有十分重要的意义。本专利技术即提供一种针对EV71所致的手足口病的高特异性的全人源单克隆抗体序列及用途。
技术实现思路
本专利技术人经过深入的研究，获得一种具有广谱中和效应的肠道病毒71型全人源单克隆抗体，本专利技术的单克隆抗体是全人源的，其重链、轻链可变区以及恒定区均来源于人的基因，因此具有免疫原性低、安全性高的特点，本专利技术提供的单克隆抗体能具有显著中和肠道病毒71型。本专利技术一方面提供一种中和肠道病毒71型的全人源单克隆抗体，其具有重链可变区和轻链可变区：(I)所述重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:14-20任一项所示；或具有SEQIDNO:14-20任一项所示氨基酸序列经替换、缺失或增加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列；(II)所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:21-26任一项所示；或具有SEQIDNO:21-26任一项所示氨基酸序列经替换、缺失或增加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。优选地，该单克隆抗体具有如下任一组重链可变区和轻链可变区：(i)重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:14所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:21所示；(7H1+23κ8组合)(ii)重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:15所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:22所示；(12H1+19κ8组合)(iii)重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:16所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:22所示；(14H1+19κ8组合)(iv)重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:17所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:22所示；(9H1+19κ8组合)(v)重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:18所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:22所示；(23H1+19κ8组合)(vi)重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:19所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:21所示。(5H1+23κ8组合)上述重链可变区和轻链可变区组成的单克隆抗体能特异性结合EV71病毒，试验结果显示，在浓度为0.05μg/ml时，7H1+23κ8组合对病毒的抑制率可达到90％，12H1与19κ8，14H1+19κ8，9H1+19κ8，23H1+19κ8和5H1+23κ8组合对病毒的抑制率可达到80％以上。在本专利技术的另一方面，提供一种编码上述单克隆抗体的核酸分子。优选地，该核酸分子具本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种中和肠道病毒71型的全人源单克隆抗体，其特征在于，其具有重链可变区和轻链可变区：/n(I)所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:14-20任一项所示；或具有SEQ ID NO:14-20任一项所示氨基酸序列经替换、缺失或增加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列；/n(II)所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:21-26任一项所示；或具有SEQ IDNO:21-26任一项所示氨基酸序列经替换、缺失或增加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种中和肠道病毒71型的全人源单克隆抗体，其特征在于，其具有重链可变区和轻链可变区：
(I)所述重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:14-20任一项所示；或具有SEQIDNO:14-20任一项所示氨基酸序列经替换、缺失或增加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列；
(II)所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:21-26任一项所示；或具有SEQIDNO:21-26任一项所示氨基酸序列经替换、缺失或增加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。


2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，其具有如下任一组重链可变区和轻链可变区：
(i)重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:14所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:21所示；
(ii)重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:15所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:22所示；
(iii)重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:16所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:22所示；
(iv)重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:17所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:22所示；
(v)重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:18所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:22所示；
(vi)重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:19所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:21所示。


3.编码如权利要求1或2所述单克隆抗体的核酸分子。


4.根据权利要求3所述的核酸分子，其特征在于，其具有如SEQID...

【专利技术属性】
技术研发人员：辛洪波，胡萍，魏强，刘苏俊，
申请(专利权)人：南昌大学，
类型：发明
国别省市：江西;36