基于中性粒细胞的活细胞探针构建方法技术

本发明专利技术涉及生物医学检测技术领域，公开了一种基于中性粒细胞的活细胞探针构建方法，包括A、BSA还原；B、合成Gd负载BSA纳米颗粒；C、Bodipy标记Gd负载BSA纳米颗粒；以及D、中性粒细胞探针构建，首先以PBS为介质，将DTNB加入至步骤C的产物溶液中，并在室温下相互作用一定时间，完成BSA纳米颗粒活化；超滤纯化后，将活化的BSA纳米颗粒用无FBS的RPMI 1640培养基稀释至0.1mg mL

Construction of living cell probe based on neutrophils

【技术实现步骤摘要】
基于中性粒细胞的活细胞探针构建方法
本专利技术涉及生物医学检测
，涉及活细胞探针的构建，尤其涉及基于中性粒细胞的活细胞探针构建方法。
技术介绍
及时准确地识别肿瘤病灶是临床癌症干预的重要前提，也是肿瘤影像学诊断的目标。基于纳米颗粒的分子影像的进展极大地提高了肿瘤检测的灵敏度和特异性。例如，受生物矿化作用的启发，前期研究成功地构建螯合钆离子(Gd3+)的牛血清白蛋白(BSA)纳米颗粒，在磁共振成像(MRI)检测肿瘤方面相较于商业化钆造影剂(DTPA)具有明显的优势。一些报道对Gd负载的纳米颗粒做进一步研究，特别是修饰上过表达的癌细胞受体的配体赋予其主动识别肿瘤的功能，在动物水平上也取得了令人鼓舞的结果。然而，由于血液循环的快速清除、有限的肿瘤靶向能力以及体内的脱靶效应，很少有基于纳米颗粒的药物递送系统被用于临床肿瘤诊断或治疗。因此，开发一种可以在血液循环中“免于检查”并且能够有效识别肿瘤微环境(TME)的成像剂仍是临床迫切需要的。在肿瘤的发生发展过程中，各种细胞因子和趋化因子可以募集大量的免疫细胞来对抗疾病，诱导形成炎性TME。受到免疫细胞对炎症的天然趋化反应的启发，基于白细胞的细胞载体被认为有可能提高纳米颗粒的不良肿瘤递送效率而越来越受到关注。在所研究的许多细胞载体中，中性粒细胞被认为是最具潜力的选择之一，原因如下：中性粒细胞是体内循环中最丰富的白细胞(50％-70％)，并且很容易获得；癌细胞分泌的各种细胞因子和肿瘤相关性粒细胞分泌的趋化因子可以引起循环中的中性粒细胞快速迁移至TME以响应炎症；与结构及功能相对单一的纳米载体相比，中性粒细胞具有多种生理机制可以逃避。免疫系统的攻击、克服各种生理屏障，使其能够特异性地靶向肿瘤区域。已有研究选择中性粒细胞作为内化载药纳米颗粒的递送平台，并在肿瘤治疗应用中表现出优异的效果。但是通过内化法递送造影剂(例如Gd)可能会受到限制，因为Gd3+在细胞内不易与自由水发生交换，从而影响螯合在蛋白质纳米颗粒上的Gd3+的高T1弛豫率。此外，成像剂的细胞内递送可能会潜在地影响中性粒细胞的活性与生物学特性，导致特异性肿瘤递送能力受损。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，依托上述研究背景，成功构建了基于中性粒细胞的活细胞探针，用于肿瘤的精确影像学诊断。专利技术人调研大量的最新生物材料文献报道，基于对自身免疫、肿瘤微环境以及纳米技术的深入研究，提出用于精准肿瘤诊断的“智能”探针的设想，主体思路如下：负载成像剂(Gd和bodipy)的BSA纳米颗粒通过DTT的还原暴露出多个自由巯基，随后这些巯基被5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)活化，即以二硫键取代DTNB中的5-硫代-2-硝基苯甲酸酯(TNB)；活化的BSA纳米颗粒再次通过取代反应与中性粒细胞表面的巯基形成二硫键交联，最终获得具有成像功能的活细胞探针(NEs探针)。为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案如下：本专利技术提供的基于中性粒细胞的活细胞探针构建方法，包括如下步骤：A、BSA还原在经标记的BSA蛋白溶液中引入还原剂以及2％SDS，在90～100℃条件下持续搅拌，充分暴露自由巯基，而后采用MES溶液稀释制备得到浓度为1mg.mL-1的工作溶液；B、合成Gd负载BSA纳米颗粒将上述工作溶液在35～40℃中振荡温育，而后加入浓度为2mmol/L的GdCl3溶液，工作溶液与GdCl3溶液的体积比为30～40:1；温育20～30min后加入0.1mmol/L的NaOH溶液，继续反应40～60min后进行超滤纯化获得Gd负载BSA纳米颗粒；C、Bodipy标记Gd负载BSA纳米颗粒Gd负载BSA纳米颗粒在NaHCO3溶液中与bodipy溶液室温下搅拌，随后超滤纯化以获得产物；D、中性粒细胞探针构建首先以PBS为介质，将DTNB加入至步骤C的产物溶液中，并在室温下相互作用一定时间，完成BSA纳米颗粒活化；超滤纯化后，将活化的BSA纳米颗粒用无FBS的RPMI1640培养基稀释至0.1mgmL-1，然后在室温下与1.25×106cells.mL-1中性粒细胞一起孵育；随后用冰冷的PBS洗涤，获得中性粒细胞探针。优选的，在步骤A中，经标记的BSA蛋白为采用FITC标记的BSA蛋白分子，其标记方法如下：将溶解在10mg.mL-1的NaHCO3溶液中的BSA蛋白与FITC，以质量比为1:40的比例混合，匀速搅拌至少5小时充分反应；随后超滤纯化得到FITC-BSA。BSA还原时，FITC-BSA蛋白溶液与还原剂DTT以摩尔比1:16混合，并与2％SDS在90℃条件下持续搅拌2小时进行还原反应，充分暴露自由巯基；而后采用浓度为0.1mg.mL-1、pH为4.4的MES溶液进行稀释。优选的，在步骤B中，工作溶液在37℃条件下以130rpm振荡温育5小时，而后加入浓度为2mmol/L的GdCl3溶液，工作溶液与GdCl3溶液的体积比为33:1；温育20min后，加入体积为工作溶液体积的25％～30％、浓度为0.1mmol/L的NaOH溶液，继续反应400min后进行超滤纯化获得Gd负载BSA纳米颗粒，该BAS纳米颗粒粒径为42nm。优选的，在步骤C中，Gd负载BSA纳米颗粒在0.1mmol/L的NaHCO3溶液中与10mg.mL-1bodipy溶液室温下搅拌1小时，随后超滤纯化获得Bodipy标记的Gd负载BSA纳米颗粒。其中，Gd负载BSA纳米颗粒与bodipy的摩尔比为1:3。优选的，步骤D中，BSA与DTNB的质量比为1:0.42，BSA纳米颗粒的活化时间为1小时；稀释后的BSA纳米颗粒在室温下与中性粒细胞的孵育时间为20min，随后用冰冷的PBS洗涤，获得中性粒细胞探针。本专利技术中，中性粒细胞的收集于小鼠腹腔，首先向小鼠腹腔内注射无菌巯基醋酸盐培养基以模拟腹腔“炎症”环境；“招募”一段时间后，用冰冷的PBS灌洗腹腔3-4遍，并参照使用说明裂解灌洗液中的红细胞，离心后用RPMI1640培养基重悬得到小鼠白细胞；随后将细胞悬液静置于37℃，5％CO2培养箱中30分钟，以去除贴壁的巨噬细胞；收集上悬液并离心(850g)，5分钟可得到小鼠中性粒细胞。前期的基础研究只是提供并在动物模型中验证了一个利用免疫细胞的天然肿瘤趋化能力提高诊断效能的智能探针的设想。在临床转化方面，可以尝试利用动物自身中性粒细胞在体内构建成像探针并实现肿瘤特异性成像，这种方式可以减少创伤以及避免潜在的自体排斥，从而增加实用性及推广性。探针制备后，专利技术人首先探究了探针对中性粒细胞的活力、形貌、膜蛋白标记以及在小鼠体内的趋化能力等生物学特性方面的影响。结果显示，纳米颗粒的锚定对中性粒细胞功能的影响不大，NEs探针保留有中性粒细胞的生理功能，可以穿过血管屏障从循环迁移到腹腔的“发炎区域”。随后，专利技术人通过小鼠皮下肺癌模型评估NEs探针的肿瘤特异性靶向能力，结果显示，中性粒细胞作为载体可以高效地递送成像剂至肿瘤区域，使得本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于中性粒细胞的活细胞探针构建方法，其特征在于，包括如下步骤：/nA、BSA还原/n在经标记的BSA蛋白溶液中引入还原剂以及2％SDS，在90～100℃条件下持续搅拌，充分暴露自由巯基，而后采用MES溶液稀释制备得到浓度为1mg.mL

【技术特征摘要】
1.一种基于中性粒细胞的活细胞探针构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
A、BSA还原
在经标记的BSA蛋白溶液中引入还原剂以及2％SDS，在90～100℃条件下持续搅拌，充分暴露自由巯基，而后采用MES溶液稀释制备得到浓度为1mg.mL-1的工作溶液；
B、合成Gd负载BSA纳米颗粒
将上述工作溶液在35～40℃中振荡温育，而后加入浓度为2mmol/L的GdCl3溶液，所述工作溶液与所述GdCl3溶液的体积比为30～40:1；温育20～30min后加入0.1mmol/L的NaOH溶液，继续反应40～60min后进行超滤纯化获得所述Gd负载BSA纳米颗粒；
C、Bodipy标记Gd负载BSA纳米颗粒
所述Gd负载BSA纳米颗粒在NaHCO3溶液中与bodipy溶液室温下搅拌，随后超滤纯化以获得产物；
D、中性粒细胞探针构建
首先以PBS为介质，将DTNB加入至步骤C的产物溶液中，并在室温下相互作用一定时间，完成BSA纳米颗粒活化；超滤纯化后，将活化的BSA纳米颗粒用无FBS的RPMI1640培养基稀释至0.1mgmL-1，然后在室温下与1.25×106cells.mL-1中性粒细胞一起孵育；随后用冰冷的PBS洗涤，获得所述中性粒细胞探针。


2.根据权利要求1所述的基于中性粒细胞的活细胞探针构建方法，其特征在于：
其中，步骤A中，经标记的BSA蛋白为采用FITC标记的BSA蛋白分子，其标记方法如下：
将溶解在10mg.mL-1的NaHCO3溶液中的BSA蛋白与FITC，以质量比为1:40的比例混合，匀速搅拌至少5小时充分反应；随后超滤纯化得到FITC-BSA。


3.根据权利要求2所述的基于中性粒细胞的活细...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯峰，邱钱赛，温亚，
申请(专利权)人：南通市肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：江苏;32