一种用于检测磷脂化重组人超氧化物歧化酶活性的试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种用于磷脂化重组人超氧化物歧化酶（PC‑SOD）活性测定的试剂盒。本发明专利技术采用在显色液中加入表面活性剂的方法，克服了PC‑SOD在反应体系中极易产生沉淀的难点，使不同浓度的PC‑SOD与吸光度形成良好的四参数拟合曲线，以达到准确测定PC‑SOD活性的目的。

A kit for detecting the activity of phospholipid recombinant human superoxide dismutase

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测磷脂化重组人超氧化物歧化酶活性的试剂盒
本专利技术涉及蛋白质医药生物工程与
，涉及一种用于检测磷脂化重组人超氧化物歧化酶活性的试剂盒。
技术介绍
PC-SOD是经磷脂酰胆碱修饰后的超氧化物歧化酶，主要用于治疗由于急性心肌梗死导致的心肌缺血再灌注损伤。由于进行了磷脂化修饰，PC-SOD具有更高的细胞亲和性，且具有易于分布到梗死部位的靶向特性，从而发挥其清除心肌缺血再灌注过程中的心肌和冠状动脉内皮细胞的胞浆和细胞外基质中的超氧自由基（O2•-），显著降低O2•־对心肌细胞和冠脉内皮细胞的损伤，减少梗死面积，改善心脏预后恢复的作用。PC-SOD的质量研究中，蛋白活性是评价其质量尤其是药效的最重要的考察指标。目前测定SOD和PC-SOD蛋白活性的方法很多，如分光光度法（如细胞色素C法、氮蓝四唑（NBT）法、可溶性四唑盐（WST）法和邻苯三酚自氧化法）、化学发光法（如光泽精探针法、荧光素衍生物（MCLA）探针法）和电子自旋共振（ESR）光谱法等。由于化学发光法和ESR光谱法存在试验条件苛刻和耗费相对较大，因此，分光光度法仍为SOD和PC-SOD活性测定方法中最为经典的方法。分光光度法测定SOD和PC-SOD活性方法中，细胞色素C法和邻苯三酚自氧化法存在灵敏度低、干扰因素多、显示不稳定等问题；WST法在测定PC-SOD时，由于SOD经磷脂酰胆碱的修饰，加之使用四唑盐，加大了蛋白间的疏水作用，反应过程极易产生沉淀，严重影响最终吸光度的检测；最为经典的NBT法在检测过程中由于甲臜水溶性较差，一定程度上也影响了PC-SOD活性的检测，此外，由于蛋白经磷脂化修饰，疏水作用增强，在较高盐浓度的情况下，疏水作用进一步加强，较易产生沉淀，产生的沉淀直接引起了吸光值偏高，最终导致四参数曲线拟合不好等问题，影响了PC-SOD活性检测的准确度。因此，开发一种有效测定PC-SOD活性的方法仍是目前亟待解决的技术难题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种检测磷脂化重组人超氧化物歧化酶活性的试剂盒，该试剂盒中在氮蓝四唑（NBT）显色液中添加有效量的表面活性剂，克服了测定过程中极易产生沉淀、四参数曲线拟合效果差等难点，提高了对PC-SOD的活性测定的有效性，有利于对其药效做出准确评价，同时有助于指导工艺，达到获得高活性PC-SOD的目的。为实现本专利技术的目的，本专利技术采用如下技术方案：一种用于检测磷脂化重组人超氧化物歧化酶活性的试剂盒，该试剂盒中含有氮蓝四唑（NBT）显色液，其中显色液中含有0.05mM~1mM黄嘌呤和0.01%~0.1%的表面活性剂，所述的表面活性剂是TritonX-100、脱氧胆酸钠或者吐温20中的一种或几种。本专利技术所述的试剂盒中，所述的表面活性剂其中优选脱氧胆酸钠或者TritonX-100，进一步优选TritonX-100。本专利技术所述的表面活性剂TritonX-100的浓度为0.02%~0.08%。某些实施例中TritonX-100的浓度为0.02%、0.05%或者0.08%。本专利技术所述的试剂盒中，黄嘌呤的浓度可进一步优选为为0.1mM~0.4mM，某些实施例中黄嘌呤的浓度为0.05mM、0.25mM或者0.4mM。本专利技术所述的试剂盒是在适量磷酸钠-EDTA缓冲溶液中，分别加入黄嘌呤、NBT和TritonX-100，使最终浓度分别为0.1mM~0.4mMmM黄嘌呤、0.25mMNBT和0.02%~0.08%TritonX-100，即为NBT显色液。本专利技术所述的试剂盒是在适量磷酸钠-EDTA缓冲溶液中，分别加入黄嘌呤、NBT和TritonX-100，使最终浓度分别为0.2mM黄嘌呤、0.25mMNBT和0.05%TritonX-100，即为NBT显色液。本专利技术所述的试剂盒用于检测磷脂化重组人超氧化物歧化酶活性，尤其是经磷脂酰胆碱修饰的铜锌超氧化物歧化酶活性的测定。本专利技术所述的试剂盒用于检测磷脂化重组人超氧化物歧化酶活性，其分析方法包括以下步骤：1、将PC-SOD用超纯水稀释至一系列浓度梯度；2、稀释后的样品分别加至96孔板中，然后加入氮蓝四唑（NBT）显色液；3、每孔加入黄嘌呤氧化酶反应液，孵育一定时间，进行显色；4、显色完毕后加入终止液，酶标仪检测吸光度；5、对样品稀释倍数和吸光度进行四参数曲线拟合，根据超氧化物歧化酶（SOD）活性标准品的活性值，计算PC-SOD的活性。其中所述步骤1中PC-SOD样品稀释梯度为3倍系列稀释，初始浓度约1000μg/ml，分别稀释1倍、3倍、9倍、27倍、81倍、243倍、729倍、2187倍，共8个稀释梯度。其中所述步骤3中，加入黄嘌呤氧化酶的浓度为1mU/ml~5mU/ml，进一步优选黄嘌呤氧化酶的浓度为2mU/ml~4mU/ml。某些实施例中黄嘌呤氧化酶的浓度为2mU/ml、2.5mU/ml或者3mU/ml。其中所述步骤3中，加入黄嘌呤氧化酶后孵育温度为37℃，孵育时间为15min~30min，进一步优选孵育时间20min~25min。其中所述步骤4中，加入终止液SDS的浓度为20mM~200mM，进一步优选SDS的浓度为50mM~150mM。某些实施例中SDS的浓度为50mU/ml、100mU/ml或者150mU/ml。本专利技术通过在反应体系中加入表面活性剂的方法，克服了测定过程中极易产生沉淀、四参数曲线拟合不好的难点，可以对PC-SOD的活性进行准确测定。本专利技术通过在反应体系中加入表面活性剂，并对检测体系进行了优化，能够准确测定PC-SOD的活性。本专利技术与现有方法相比，完全克服了现有方法检测PC-SOD检测过程中出现的沉淀问题，能够准确得出PC-SOD的活性，有利于对其药效做出正确评价，有助于指导工艺，达到获得高活性PC-SOD的目的。附图说明图1：实施例1市售SOD活性检测（NBT法）试剂盒检测PC-SOD活性曲线图；图2：实施例2反应体系加入脱氧胆酸钠检测PC-SOD活性曲线图；图3：实施例3反应体系加入吐温20检测PC-SOD活性曲线图；图4：实施例4反应体系加入TritonX-100检测PC-SOD活性曲线图；图5：实施例5方法检测PC-SOD活性曲线图。具体实施方式为了进一步阐述本专利技术，下面将结合本专利技术的具体实施例，对本专利技术实施例中的技术方法进行清楚、完整地描述。如无特殊说明，本专利技术实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。实施例1、市售SOD活性检测（NBT法）试剂盒检测PC-SOD活性（1）样品稀释用超纯水将PC-SOD样品溶液稀释为约1000μg/ml，然后进行3倍系列稀释，分别稀释1倍、3倍、9倍、27倍、81倍、243倍、729倍、2187倍，共8个稀释梯度；（2）加样取稀释后的样品20μl分别加至96孔板中，然后每孔加入NBT显色液180μl，轻轻振荡96孔板；（3）显色反应...

【技术保护点】
1.一种用于检测磷脂化重组人超氧化物歧化酶活性的试剂盒，该试剂盒中含有氮蓝四唑显色液，其中显色液中含有0.05mM~1mM黄嘌呤和0.01%~0.1%的表面活性剂，所述的表面活性剂是Triton X-100、脱氧胆酸钠或者吐温20中的一种或几种。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于检测磷脂化重组人超氧化物歧化酶活性的试剂盒，该试剂盒中含有氮蓝四唑显色液，其中显色液中含有0.05mM~1mM黄嘌呤和0.01%~0.1%的表面活性剂，所述的表面活性剂是TritonX-100、脱氧胆酸钠或者吐温20中的一种或几种。


2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于所述的试剂盒中的表面活性剂是脱氧胆酸钠或者TritonX-100，进一步优选TritonX-100。


3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的表面活性剂TritonX-100的浓度为0.02%~0.08%。


4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的黄嘌呤的浓度可进一步优选为为0.1mM~0.4mM。


5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒用于检测经磷脂酰胆碱修饰的铜锌超氧化物歧化酶活性。


6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于本发明所述的试剂盒是在适量磷酸钠-EDTA缓冲溶液中，分别加入黄嘌呤、NBT和TritonX-100，使最终浓度分别为0.1mM~0.4mMmM黄嘌呤、0.25mMNBT和0.02%~0.08%T...

【专利技术属性】
技术研发人员：何景昌，胡炳旭，刘福星，孙涛，刘利波，
申请(专利权)人：北京泰德制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11