提高L-精氨酸菌株生产能力的方法技术

本发明专利技术公开了一种通过基因工程提高L‑精氨酸菌株生产能力的方法，包括下述步骤：敲除谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组中的argR基因，获得基因敲除菌株ATCC13032(ΔargR)；对基因敲除菌株的基因组中argB基因进行A26V和M31V突变，获得基因突变菌株ATCC13032(ΔargR,argBmut(A26V M31V))；对基因突变菌株的基因组中多聚磷酸盐激酶基因(NCgl2620)起始密码子上游调控区的碱基序列进行突变，获得基因工程菌株ATCC13032(ΔargR,argBmut(A26V M31V),NCgl2620mut6)。本发明专利技术的方法能够将菌株的L‑精氨酸生产能力提高至少15倍。

Methods to improve the production capacity of L-arginine strains

【技术实现步骤摘要】
提高L-精氨酸菌株生产能力的方法
本专利技术属于基因工程领域，具体地说，涉及一种提高L-精氨酸菌株生产能力的方法，尤其涉及一种通过基因工程提高L-精氨酸产生菌生产能力的方法。
技术介绍
L-精氨酸(L-argnine，简称L-Arg)是人体内所需半必需碱性氨基酸之一，作为一种含有胍基的碱性氨基酸，是生物体尿素循环的一种重要中间代谢物，具有多种独特的生理和药理作用，对于治疗生理功能、心血管疾病、激励免疫系统、维持婴儿的营养平衡、促进人体解毒等都具有良好的疗效，被专家称为是机体内运输和贮存氨基酸的重要载体，在肌内代谢中极为重要。它是合成胞浆蛋白和核蛋白的必需氨基酸；作为唯一的氨来源参与肌酸的合成；作为尿素循环的重要中间体，在肝脏中扮演着排除多余氨的角色，防止氨过量积累而引起中毒；它还具有调节人体免疫力的功能，可抑制肿瘤生长、促进受伤组织愈合等。并且，精氨酸是一氧化氮、尿素、鸟氨酸及肌丁胺的直接前体，是合成肌肉素的重要原素，且被用作聚胺、瓜氨酸及谷氨酰胺的合成。因此，L-精氨酸在医药、食品及化工领域方面具有重要而广泛的应用。比如，在临床上，除作为复方本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高L-精氨酸菌株生产能力的方法，包括以下步骤：/nA.敲除谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组中的argR基因，获得基因敲除菌株ATCC13032(ΔargR)；/nB.对步骤A中所述基因敲除菌株ATCC13032(ΔargR)的基因组中argB基因进行A26V和M31V突变，获得基因突变菌株ATCC13032(ΔargR,argBmut(A26V M31V))；/nC.对步骤B中所述基因突变菌株ATCC13032(ΔargR,argBmut(A26V M31V))的基因组中多聚磷酸盐激酶基因(NCgl2620)起始密码子上游调控区的碱基序列进行突变，由SEQ IDNO:13突变为S...

【技术特征摘要】
1.一种提高L-精氨酸菌株生产能力的方法，包括以下步骤：
A.敲除谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组中的argR基因，获得基因敲除菌株ATCC13032(ΔargR)；
B.对步骤A中所述基因敲除菌株ATCC13032(ΔargR)的基因组中argB基因进行A26V和M31V突变，获得基因突变菌株ATCC13032(ΔargR,argBmut(A26VM31V))；
C.对步骤B中所述基因突变菌株ATCC13032(ΔargR,argBmut(A26VM31V))的基因组中多聚磷酸盐激酶基因(NCgl2620)起始密码子上游调控区的碱基序列进行突变，由SEQIDNO:13突变为SEQIDNO:14，获得L-精氨酸生产能力比所述基因突变菌株提高的基因工程菌株ATCC13032(ΔargR,argBmut(A26VM31V),NCgl2620mut6)。


2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A中所述基因敲除菌株ATCC13032(ΔargR)通过下述方法制备：
A1.以ATCC13032基因组为模板，使用序列为SEQIDNO:1的引物argR-aL-F和序列为SEQIDNO:2的引物argR-aL-R进行PCR扩增，得到约1kb的argR-aL片段；
A2.以ATCC13032基因组为模板，使用序列为SEQIDNO:3的引物argR-aR-F和序列为SEQIDNO:4的引物argR-aR-R进行PCR扩增，得到约1kb的argR-aR片段；
A3.使用HindIII和EcoRI酶切GenBank登录号为FJ437239.1的质粒pK18mobsacB，胶回收得到5.7kb载体片段；
A4.Gibson连接上述argR-aL片段、argR-aR片段和载体片段，转化DH5α感受态细胞，涂布卡那霉素LB平板，过夜培养；
A5.使用引物argR-aL-F和argR-aR-R进行PCR扩增验证转化子，得到质粒pK18mobsacB-argR；
A6.制备谷氨酸棒状杆菌ATCC13032感受态细胞；
A7.将质粒pK18mobsacB-argR转化入ATCC13032感受态细胞；
A8.进行SacB蔗糖反筛，使用引物argR-aL-F和argR-aR-R进行PCR扩增，验证在BHIS平板生长而在含卡那霉素的BHIS平板不能生长的转化子，得到菌株ATCC13032(ΔargR)。


3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤B中所述基因突变菌株通过下述方法制备：
B1.以ATCC13032基因组为模板，使用序列为SEQIDNO:5的引物argB-aL-F和序列为SEQIDNO:6的引物argB-aL-R进行PCR扩增，得到约1kb的argB-aL片段；
B2.以ATCC13032基因组为模板，使用序列为SEQIDNO:7的引物argB-aR-F和序列为SEQIDNO:8的引物argB-aR-R进行PCR扩增，得到约1kb的argB-aR片段；
B3.使用HindIII和EcoRI酶切GenBank登录号为FJ437239.1的质粒pK18mobsacB，胶回收得到5.7kb载体片段；
B4.Gibson连接上述argB-aL片段、argB-aR片段和载体片段，转化DH5α感受态细胞，涂布卡那霉素LB平板，过夜培养；
B5.使用引物argB-aL-F和argB-aR-R进行PCR扩增验证转化子，得到质粒pK18mobsacB-argBmut；
B6.制备谷氨酸棒状杆菌ATCC13032(ΔargR)感受态细胞；
B7.将质粒pK18mobsacB...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨晟，蒋宇，杨俊杰，董枫，刘映淼，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：上海;31