高产反式-4-羟基-L-脯氨酸的大肠杆菌菌株及其构建方法技术

本发明专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种高产反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸的大肠杆菌菌株的构建及应用。技术方案为：一种高产反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸的大肠杆菌，在所述大肠杆菌中引入L‑脯氨酸‑反式‑4‑羟化酶基因；所述大肠杆菌的putA基因、poxB基因、ldhA基因、pflB基因、pta基因、pdhR基因、adhE基因、aceA基因被敲除；对proB、proC基因的启动子和5＇UTR序列进行编辑；对proA的5＇UTR序列进行编辑；对proB基因引入I69E突变。使用本发明专利技术构建的工程菌及发酵方法，可以葡萄糖为原料，在不外加L‑脯氨酸等底物的情况下，从头开始高效合成反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸，最高产量可达4.82g/L。

Escherichia coli strains with high production of trans-4-hydroxy-l-proline and its construction method

The invention belongs to the field of genetic engineering, in particular to the construction and application of an Escherichia coli strain with high yield of trans-4-hydroxy-l-proline. The technical scheme is as follows: a high-yield E.coli with trans-4-hydroxy-l-proline is introduced into the E.coli, and the l-proline-trans-4-hydroxylase gene is introduced into the E.coli; the puta gene, poxb gene, ldhA gene, pflb gene, PTA gene, pdhr gene, adhe gene and ACEA gene of the E.coli are knocked out; the promoter and 5'UTR sequence of prob and proc genes are carried out Editing; editing 5'UTR sequence of proa; introducing i69e mutation into prob gene. By using the engineering bacteria and fermentation method constructed by the invention, the trans \u2011 4 \u2011 hydroxy \u2011 L \u2011 proline can be efficiently synthesized from the beginning without adding L \u2011 proline and other substrates, and the maximum yield can reach 4.82g/l.

【技术实现步骤摘要】
高产反式-4-羟基-L-脯氨酸的大肠杆菌菌株及其构建方法
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种高产反式-4-羟基-L-脯氨酸的大肠杆菌菌株的构建及应用。
技术介绍
反式-4-羟基-L-脯氨酸(trans-4-hydroxy-L-proline，简称HYP)是L-脯氨酸的4-羟基化产物，是胶原蛋白的主要组成氨基酸，被广泛应用于医药、化工、饲料、食品营养和美容等行业。HYP的主要制备方法为酸水解法：以胶原蛋白为原料，通过酸水解、亚硝酸氧化和离子交换等过程获得。但存在原料消耗量大、三废排放量大、能耗高、终产物纯度低、生产成本高等缺点。另外，虽然也可通过化学合成的方法制备HYP，但又存在合成路线较长、成本太高、难以产业化等缺陷。与之相对的，微生物发酵法因具有原料成本低、反应条件温和、易大规模生产等优势，逐渐成为广受关注的化合物合成新方法；为HYP的合成提供了新思路。YulanYi等将来源于不同物种的L-脯氨酸-反式-4-羟化酶基因(P4H)构建到大肠杆菌或者谷氨酸棒杆菌表达载体上，直接转化大肠杆菌BL21(DE3)或者谷氨酸棒杆菌，在MEC本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高产反式-4-羟基-L-脯氨酸的大肠杆菌，其特征在于：在所述大肠杆菌中引入L-脯氨酸-反式-4-羟化酶基因；敲除大肠杆菌的putA基因、poxB基因、ldhA基因、pflB基因、pta基因、pdhR基因、adhE基因和aceA基因；对proB、proC基因的启动子和5＇UTR序列进行编辑；对proA的5＇UTR序列进行编辑；对proB基因引入I69E突变。/n

【技术特征摘要】
1.一种高产反式-4-羟基-L-脯氨酸的大肠杆菌，其特征在于：在所述大肠杆菌中引入L-脯氨酸-反式-4-羟化酶基因；敲除大肠杆菌的putA基因、poxB基因、ldhA基因、pflB基因、pta基因、pdhR基因、adhE基因和aceA基因；对proB、proC基因的启动子和5＇UTR序列进行编辑；对proA的5＇UTR序列进行编辑；对proB基因引入I69E突变。


2.根据权利要求1所述的一种高产反式-4-羟基-L-脯氨酸的大肠杆菌，其特征在于：所述大肠杆菌的aceK基因被敲除。


3.根据权利要求2所述的一种高产反式-4-羟基-L-脯氨酸的大肠杆菌，其特征在于：所述大肠杆菌的gdhA基因的启动子和5＇UTR序列被编辑。


4.根据权利要求3所述的一种高产反式-4-羟基-L-脯氨酸的大肠杆菌，其特征在于：所述大肠杆菌的icd基因的启动子和5＇UTR序列被编辑。


5.一种高产反式-4-羟基-L-脯氨酸的大肠杆菌的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)敲除大肠杆菌BL21(DE3)的putA基因，引入L-脯氨酸-反式-4-羟化酶基因，获得工程菌21-S1；
(2)敲除所述工程菌21-S1中的poxB基因、ldhA基因、pflB基因、pta基因、pdhR基因和adhE基因，获得工程菌21-S2；
(3)敲除所述工程菌21-S2中的aceA基因，获得工程菌21-S3；
(4)对所述工程菌21-S3的proB、proC基因的启动子和5＇UTR序列进行编辑，对proA基因的5＇UTR序列进行编辑，对所述proB基因引入I69E突变，获得工程菌21-S4；
(5)敲除所述工程菌21-S4中的aceK基因，获得工程菌21-S5；
所述21-S5即为所需的大肠杆菌。


6.根据权利要求5所述的高产反式-4-羟基-L-脯氨酸的大肠杆菌的构建方法，其特征在于：所述步骤(5)后还包括如下步骤：
(6)对所述工程菌21-S5中gdhA基因的启动子和5＇UTR序列进...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗应刚，姜良珍，庞静，张国林，
申请(专利权)人：中国科学院成都生物研究所，
类型：发明
国别省市：四川;51