一种数字PCR芯片的制备及修饰方法技术

本发明专利技术提供了一种数字PCR芯片的制备及修饰方法，选择硅材料作为芯片基层；将芯片基层单一面抛光后，再将高分子材料嵌合在芯片基层的抛光面上，接着去除高分子材料表面的保护膜形成高分子材料面板；将步骤2中高分子材料面板进行烘烤后，在曝光机上通过曝光在表面形成反应微孔的密排图形列阵；将步骤3中得到的密排图形列阵在显影液中浸泡后烘干；将步骤4中烘干后的高分子材料面板划片，完成数字PCR芯片的制备；修饰方法为数字PCR芯片通过等离子体机进行等离子体处理后，接着进行数字PCR反应。解决了现有技术中数字PCR芯片加工工艺复杂、成本昂贵、芯片的通量低以及芯片使用的简易性等问题。

Preparation and modification of a digital PCR chip

【技术实现步骤摘要】
一种数字PCR芯片的制备及修饰方法
本专利技术属于PCR
，具体涉及一种数字PCR芯片的制备及修饰方法。
技术介绍
数字PCR(digitalpolymerasechainreaction，dPCR)一般包括两部分内容，即PCR扩增和荧光信号分析。在PCR扩增阶段，数字PCR先将样品稀释到单分子水平，再平均分配到几十至几万个单元中进行反应。与实时荧光定量PCR(realtimequantitativePCR，qPCR)对每个循环进行实时荧光测定的方法不同，数字PCR是在扩增结束后对每个反应单元的荧光信号进行采集，有荧光信号记为1，无荧光信号记为0，有荧光信号的反应单元中至少包含一个拷贝的。理论上，在样品中目标DNA浓度极低的情况下，有荧光信号的反应单元数目等于目标DNA分子的拷贝数。但是，通常每反应单元中可能包含两个或两个以上的目标分子，就需要使用泊松概率分布函数(Poissondistribution)进行计算，根据反应单元总数、有荧光信号的单元数以及样品的稀释系数，就可以得到样本的最初拷贝数(浓度)。随着微流体技术、纳米制造技术和微电子技术等的发展，微流控芯片技术的使用使数字PCR能够快速并准确地将样品流体分成若干个独立的单元，进行多步平行反应，成本低、体积小和高通量，是理想的数字PCR平台。目前已报道的数字PCR系统主要采用硅、玻璃、PDMS等构成，其中PDMS材料具有优良的生物惰性、较好的透光性，在数字芯片中得到了广泛的应用。但是在数字PCR芯片的应用中具有一定的局限性，主要是由于PDMS具有一定程度的透气性，而PCR的热循环温度较高，高温一般在94-95℃，同时在预变性过程中还需要在高温阶段维持5-10分钟，由于PCR热循环过程的高温已经接近水的沸点100℃，如果密封材料具有一定透气性势必会使水蒸气挥发造成反应液中水溶剂减少，反应液的成分浓度发生变化，当热循环温度降低时，由于反应池高温时水分的挥发形成负压，环境中的气体同样会由于PDMS的透气性进入到反应池中形成气泡，进而影响反应池的密封。同时PDMS的热导率较差(约0.18W/mK)，利用其制备的PCR芯片在热循环过程中热传递效率较低，如果在不延长热循环时间的前提下必然会对PCR扩增效率造成影响。现有技术目前采用全部硅基制作，价格贵、加工周期长、操作复杂、加工工艺繁琐等等缺点，这些缺点的主要原因在于之前专利内容所述所采用的材料为硅基加工芯片，硅基芯片本身价格昂贵，而且由于芯片本身材料的问题加工工艺及成本问题会造成量产及实际使用等方面的困难。现有专利技术CN105039153B一种硅基阵列微反应池数字PCR芯片及其制备方法。该芯片主要包括上盖和芯片，其中在芯片上有蜂窝状排列的微孔，上盖固定于芯片槽上。具体步骤为选择一单面抛光的硅片，清洗，在硅片抛光面上旋涂一层均匀的光刻胶，通过曝光形成圆形的图形阵列，在圆形的图形阵列掩膜下干法刻蚀硅，形成微孔结构，去胶划片，完成芯片制备。但是该专利技术在芯片的制备过程中需要对芯片表面和微孔内部进行二次修饰。现有专利CN104745461A公开了一种用于测序的基因芯片及其制备方法，具体步骤为：取单面抛光的基片；以二甲基亚砜水浴，然后以甲醇与水的混合液水浴，以水冲洗，吹片烘干；在芯片抛光面上涂光刻胶，通过曝光在表面形成反应池图形；刻蚀芯片，形成反应池；以二甲基亚砜水浴，以硫酸双氧水混合液浸泡，以水冲洗，完成芯片的制备。
技术实现思路
本专利技术为解决现有技术中数字PCR芯片加工工艺复杂、成本昂贵、芯片的通量低以及芯片使用的简易性等问题，提供了一种数字PCR芯片的制备及修饰方法，具体技术方案如下：一种数字PCR芯片的制备方法，具体步骤如下：步骤1：选择硅材料作为芯片基层；步骤2：将芯片基层单一面抛光后，再将高分子材料嵌合在芯片基层的抛光面上，接着去除高分子材料表面的保护膜形成高分子材料面板；步骤3：将步骤2中高分子材料面板进行烘烤后，在曝光机上通过曝光在表面形成反应微孔的密排图形列阵；步骤4：将步骤3中得到的密排图形列阵在显影液中浸泡后烘干；步骤5：将步骤4中烘干后的高分子材料面板划片，完成数字PCR芯片制备。优选地，所述步骤2中高分子材料的厚度范围为15-25μm。优选地，所述步骤3中反应微孔为正六边形或正方形。具体地，所述步骤2中高分子材料为感光厚环氧树脂片，该感光厚环氧树脂片由包含阳离子固化改性环氧树脂的光阻构成。具体地，所述环氧树脂的光阻中含有无锑的光酸生成剂，并在一个严格控制的无溶剂的过程中制备。优选地，所述步骤2中嵌合过程是在65℃下使用压膜机进行嵌合。优选地，所述步骤3中烘烤温度为95℃，烘烤时间为10min。优选地，所述步骤4中浸泡时间为10min。具体地，数字PCR芯片的修饰方法为：将步骤5中制得的芯片通过等离子体机进行等离子体处理后，接着进行数字PCR反应。具体地，数字PCR芯片的另一种修饰方法为：S1、将步骤5中制得的芯片通过等离子体机进行等离子体处理后得到芯片A，S2、将步骤S1中的芯片A置于牛血清白蛋白中进行浸泡，然后进行烘干处理后直接使用。优选地，所述步骤S2中牛血清白蛋白的浓度范围是10mg/mL，所述步骤S2中浸泡时间范围为15-30min。本专利技术具有以下有益效果：1、采用高分子材料嵌合在硅基芯片上，在高分子材料上进行密排孔加工，减少了加工流程、降低了加工成本；本申请中使用的高分子材料本身的性质可以降低数字PCR芯片的加工难易程度及加工成本，在保证加工成功率的前提下能够适用于商业化大规模生产；2、选取了15-25μm厚的高分子材料作为反应微孔的发生材料，保证了反应微孔的深宽比，从而大幅度提升反应试剂的进孔效率，保证了数字PCR反应发生的效率；3、通过芯片的修饰处理也能够大幅度提升反应试剂的进孔效率及反应发生的效率。附图说明图1为数字PCR芯片尺寸示意图；图2为数字PCR芯片正六边形图形阵列示意图；图3为数字PCR芯片正六边形图形阵列右上角尺寸示意图；图4为数字PCR芯片正六边形图形阵列左下角尺寸示意图；图5为数字PCR芯片正方形图形阵列示意图；图6为数字PCR芯片正方形图形阵列右上角尺寸示意图；图7为数字PCR芯片正方形图形阵列左下角尺寸示意图；图8为数字PCR芯片制备方法的流程示意图。具体实施方式实施例1一种数字PCR芯片的制备方法，具体步骤如下：步骤1：选择硅材料作为芯片基层；步骤2：将芯片基层单一面抛光后，再将高分子材料在65℃下使用压膜机嵌合在芯片基层的抛光面上，接着去除高分子材料表面的保护膜形成高分子材料面板；高分子材料的厚度为25μm；高分子材料为感光厚环氧树脂片，该感光厚环氧树脂片由包含阳离子固化改性环氧树脂的光阻构成；所述环氧树脂的光阻中含有无锑的光酸生成剂，并在一个严格控制本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种数字PCR芯片的制备方法，具体步骤如下：/n步骤1：选择硅材料作为芯片基层；/n步骤2：将芯片基层单一面抛光后，再将高分子材料嵌合在芯片基层的抛光面上，接着去除高分子材料表面的保护膜形成高分子材料面板；/n步骤3：将步骤2中高分子材料面板进行烘烤后，在曝光机上通过曝光在表面形成反应微孔的密排图形列阵；/n步骤4：将步骤3中得到的密排图形列阵在显影液中浸泡后烘干；/n步骤5：将步骤4中烘干后的高分子材料面板划片，完成数字PCR芯片的制备。/n

【技术特征摘要】
1.一种数字PCR芯片的制备方法，具体步骤如下：
步骤1：选择硅材料作为芯片基层；
步骤2：将芯片基层单一面抛光后，再将高分子材料嵌合在芯片基层的抛光面上，接着去除高分子材料表面的保护膜形成高分子材料面板；
步骤3：将步骤2中高分子材料面板进行烘烤后，在曝光机上通过曝光在表面形成反应微孔的密排图形列阵；
步骤4：将步骤3中得到的密排图形列阵在显影液中浸泡后烘干；
步骤5：将步骤4中烘干后的高分子材料面板划片，完成数字PCR芯片的制备。


2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2中高分子材料的厚度范围为15-25μm。


3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3中反应微孔为正六边形或正方形。


4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2中高分子材料为感光厚环氧树脂片，该感光厚环氧树脂片由包含阳离子固化改性环氧树脂的光阻构成。


5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述环氧树脂的光阻中含有无锑的光酸生成剂，并在一个严格控制的无...

【专利技术属性】
技术研发人员：隋硕，金鑫浩，刘一博，任鲁风，张未来，俞育德，于军，
申请(专利权)人：宁波胤瑞生物医学仪器有限责任公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33