一种从海葡萄中酶法制备活性β-1,3-木寡糖的方法技术

本发明专利技术公开了一种从海葡萄中酶法制备活性β‑1，3‑木寡糖的方法，括如下步骤：(1)从海葡萄中提取β‑1，3‑木聚糖；(2)获得重组β‑1，3‑木聚糖酶；(3)以上述重组β‑1，3‑木聚糖酶水解步骤(1)所得的物料，以获得所述活性β‑1，3‑木寡糖。现有技术中的木聚糖都是β‑1，4‑木聚糖及β‑1，4‑木寡糖(低聚木糖)，而本发明专利技术从来源于海葡萄的β‑1，3‑木聚糖中利用酶法制备β‑1，3‑木寡糖，填补了国内空白，同时经过测验，本发明专利技术制得的β‑1，3‑木寡糖与β‑1，4‑木寡糖相比，具有更好的活性。

A method of preparing active \u03b2 - 1,3-xylooligosaccharide from sea grape by enzymatic method

The invention discloses a method for preparing active \u03b2 \u2011 1,3 \u2011 Xylan from sea grape by enzymatic method, which comprises the following steps: (1) extracting \u03b2 \u2011 1,3 \u2011 Xylan from sea grape; (2) obtaining recombinant \u03b2 \u2011 1,3 \u2011 xylanase; (3) obtaining the material obtained by the hydrolysis step (1) of the recombinant \u03b2 \u2011 1,3 \u2011 xylanase to obtain the active \u03b2 \u2011 1,3 \u2011 xylanase. The xylans in the prior art are all \u03b2 \u2011 1,4 \u2011 xylans and \u03b2 \u2011 1,4 \u2011 Xylooligosaccharides (Xylooligosaccharides), while the invention uses enzymatic method to prepare \u03b2 \u2011 1,3 \u2011 Xylooligosaccharides from \u03b2 \u2011 1,3 \u2011 xylans from sea grapes, which fills up the domestic blank. At the same time, after testing, the \u03b2 \u2011 1,3 \u2011 Xylooligosaccharides prepared by the invention have better activity compared with \u03b2 \u2011 1,4 \u2011 Xylooligosaccharides.

【技术实现步骤摘要】
一种从海葡萄中酶法制备活性β-1，3-木寡糖的方法
本专利技术属于木寡糖制备
，具体涉及一种从海葡萄中酶法制备活性β-1，3-木寡糖的方法。
技术介绍
自然界中植物藻类有一种主要的组成部分，半纤维素，半纤维素是第二大丰富的多聚糖，仅次于纤维素，含量约占20％～30％，其主要成分是1，4-木聚糖。可以用酸性水解和酶水解两种方法水解木聚糖获得低聚木糖或木糖，且均可提高木聚糖的利用率和经济价值。酸性水解需在高温高压下进行，产品回收率和仪器成本较高，同时，由于该方法在加工过程中会产生副产物，从而减少木聚糖的水解转化率。而酶解法具有特异性高，加工条件温和，产品易于回收的特点。除用于生产1，4-低聚木糖外，该方法也泛用于食品和化妆品工业、制药生物技术、农业、环境保护和污水处理。需要指出的是，目前常说的木聚糖或者低聚木糖都是指1，4-木聚糖或者1，4-木寡糖。而某些海藻中含有特殊1，3-键连接的1，3-木聚糖，和现有的1，4-木聚糖在结构和活性上存在明显差异，是不同于1，4-木聚糖的另外一种物质。从中获得的1，3-低聚糖具有许多生物活性，其活性受分子量(MW)和化学键的影响，在医学方面例如抗癌、抗病毒以及抗氧化等都有一定的效果。海藻多糖是一种较易提取的生物成分，在分子结构上存在很大的差异。近年来，藻类多糖降解的寡糖已被应用于治疗慢性疾病，一些报道揭示了β-1，3-木聚糖的抗癌、抗病毒和抗炎活性，例如诱导MCF-7人乳腺癌细胞凋亡。β-1，3-木聚糖是由β-1，3键连接D-木糖组成的，是某些海藻细胞壁特有的多糖组分，主要存在于如Caulerpa、Bryopans、Bangia、紫菜和Palmariaspp等大型藻类中。β-1，3-木聚糖分子大量存在藻类细胞的细胞壁中，主要以右手三股螺旋结构结合成六角晶体微纤维的形式存在，这些微纤维随机的分布在海藻细胞的周围，具有重要的保护作用。大多数以β-1，3-木聚糖作为细胞壁结构主要组成成分的藻类都与人类活动密切相关：据已有的研究可知，管藻目绿藻中含有β-1，3-木聚糖，其中有两种蕨藻较为常见，一种是目前已经可以人工养殖的可使用的长颈蕨海葡萄，另一种是高度入侵物种杉叶蕨藻，所以通常选择长颈蕨海葡萄作为提取β-1，3-木聚糖的实验原料。但现有技术对于木寡糖(低聚木糖)的制备一般都是β-1，4-木聚糖的制备，例如CN108359696A公开的一种低聚木糖的制备方法，通过甘蔗渣发酵液生成2-10个木糖分子以(β-1-4)糖苷键连接而成的低聚糖；再如CN104762343A公开的一种酶法制备低聚木糖的方法，是由内切葡聚糖酶EGI基因在巴斯德毕赤酵母(PichiaPastoris)中表达，得到的内切葡聚糖酶EGI用于降解木聚糖制备低聚木糖，该低聚木糖同样是由2～10个木糖分子以β-1，4-糖苷键连接而成的低聚合度糖类，其有效成分为β-1，4木二糖、β-1，4木三糖、β-1，4木四糖、β-1，4木五糖等。而现有技术对于β-1，3-木聚糖的制备和研究尚不够全面：国内尚没有1，3-低聚木糖的制备方法，也无法从市面上买到1，3-低聚木糖，国外的针对1，3-低聚木糖的制备不仅方法复杂而且效果不佳，而且也没有商品化的1，3-低聚木糖出售。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种从海葡萄中酶法制备活性β-1，3-木寡糖的方法。本专利技术的技术方案如下：一种从海葡萄中酶法制备活性β-1，3-木寡糖的方法，包括如下步骤：(1)从海葡萄中提取β-1，3-木聚糖；(2)获得重组β-1，3-木聚糖酶；(3)以上述重组β-1，3-木聚糖酶水解步骤(1)所得的物料，以获得所述活性β-1，3-木寡糖，具体包括：a、将步骤(1)所得的物料加入到pH为6.9-7.2的Tris-HCl缓冲液，制成浓度为0.8-1.2wt％的β-1，3-木聚糖溶液；b、将上述β-1，3-木聚糖溶液与适量上述重组β-1，3-木聚糖酶混合后，于44-46℃反应20-30h，接着置于95-100℃加热4-6min，使上述重组β-1，3-木聚糖酶失活；c、将步骤b所得的物料于11000-13000rpm离心4-6min，所得上清液即为所述活性β-1，3-木寡糖。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述步骤(1)包括：a、将海葡萄粉与适量NaOH溶液混合，边搅拌边加热并充分煮沸25-35min；b、将步骤a所得物料以3500-4500rpm离心15-25min，将所得第一沉淀用蒸馏水充分洗涤；c、在步骤b所得的物料中加入适量H2SO4溶液，以3500-4500rpm离心15-25min，获得第二沉淀；d、在上述第二沉淀中加入适量NaOH溶液，冰浴条件下搅拌提糖1.5-2h，然后将所得物料进行离心，得上清液；e、将该上清液与无水乙醇以1∶3-5的体积比混合，于3-5℃静置10-12h，经固液分离获得第三沉淀；f、向上述第三沉淀中加入适量高氯酸钠溶液，边搅拌边脱色1.5-2.5h，再用蒸馏水充分洗涤，得第四沉淀；g、将上述第四沉淀于9500-12000rpm离心12-20min，获得第五沉淀；h、将上述第五沉淀用乙酸溶液充分吹洗，再用蒸馏水充分洗涤，获得β-1，3-木聚糖。所述步骤(1)的步骤a中的海葡萄粉为经过预处理的海葡萄粉，该预处理的过程包括：a1、将海葡萄粉与纯净水混合后，于亚临界水状态下萃取5min～20min，冷却至室温后离心收集上清液，然后冷冻干燥。更进一步优选的，所述预处理的过程还包括：a2、在室温下将蒸馏水13-14重量份、盐酸0.1-0.2重量份、葡萄糖4-5重量份、无水乙醇9-12重量份和正硅酸乙酯50-60重量份依次加入到反应容器中，迅速搅拌4-6min，液体依次经历透明-混浊-透明状变化，用室温水冷却降温，充分去除乙醇，以形成预水解凝胶；a3、向预水解凝胶中加入16-17重量份的所述冷冻干燥后的物料，并用碱调节pH至5.4-5.6，低速搅拌25-35min后，于3-5℃静置45-50h，获得湿胶；a4、将上述湿胶研磨粉碎，用蒸馏水充分洗涤以去除其中的葡萄糖，再经过滤、干燥和研磨粉碎过筛，即成。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述步骤(1)为：从海葡萄中提取β-1，3-木聚糖，取其中适量β-1，3-木聚糖制成羟基醇β-1，3-木聚糖，再与剩下的β-1，3-木聚糖混合。进一步优选的，所述羟基醇β-1，3-木聚糖占步骤(1)所得的物料的5-10wt％。更进一步优选的，所述羟基醇β-1，3-木聚糖的制备方法包括：I、将β-1，3-木聚糖溶解于NaOH溶液中，再加入适量二氯乙醇，冰浴搅拌0.8-1.5h，再于室温下搅拌20-25h；II、在步骤I所得的物料中加入冰醋酸，于冰浴下中和，然后进行透析；III、将步骤III所得的物料加热搅拌浓缩，再经冷冻干燥，即得所述羟基醇β-1，3-木聚糖。本专利技术的有益效果是：<本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从海葡萄中酶法制备活性β-1，3-木寡糖的方法，其特征在于：包括如下步骤：/n(1)从海葡萄中提取β-1，3-木聚糖；/n(2)获得重组β-1，3-木聚糖酶；/n(3)以上述重组β-1，3-木聚糖酶水解步骤(1)所得的物料，以获得所述活性β-1，3-木寡糖，具体包括：/na、将步骤(1)所得的物料加入到pH为6.9-7.2的Tris-HCl缓冲液，制成浓度为0.8-1.2wt％的β-1，3-木聚糖溶液；/nb、将上述β-1，3-木聚糖溶液与适量上述重组β-1，3-木聚糖酶混合后，于44-46℃反应20-30h，接着置于95-100℃加热4-6min，使上述重组β-1，3-木聚糖酶失活；/nc、将步骤b所得的物料于11000-13000rpm离心4-6min，所得上清液即为所述活性β-1，3-木寡糖。/n

【技术特征摘要】
1.一种从海葡萄中酶法制备活性β-1，3-木寡糖的方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)从海葡萄中提取β-1，3-木聚糖；
(2)获得重组β-1，3-木聚糖酶；
(3)以上述重组β-1，3-木聚糖酶水解步骤(1)所得的物料，以获得所述活性β-1，3-木寡糖，具体包括：
a、将步骤(1)所得的物料加入到pH为6.9-7.2的Tris-HCl缓冲液，制成浓度为0.8-1.2wt％的β-1，3-木聚糖溶液；
b、将上述β-1，3-木聚糖溶液与适量上述重组β-1，3-木聚糖酶混合后，于44-46℃反应20-30h，接着置于95-100℃加热4-6min，使上述重组β-1，3-木聚糖酶失活；
c、将步骤b所得的物料于11000-13000rpm离心4-6min，所得上清液即为所述活性β-1，3-木寡糖。


2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)包括：
a、将海葡萄粉与适量NaOH溶液混合，边搅拌边加热并充分煮沸25-35min；
b、将步骤a所得物料以3500-4500rpm离心15-25min，将所得第一沉淀用蒸馏水充分洗涤；
c、在步骤b所得的物料中加入适量H2SO4溶液，以3500-4500rpm离心15-25min，获得第二沉淀；
d、在上述第二沉淀中加入适量NaOH溶液，冰浴条件下搅拌提糖1.5-2h，然后将所得物料进行离心，得上清液；
e、将该上清液与无水乙醇以1∶3-5的体积比混合，于3-5℃静置10-12h，经固液分离获得第三沉淀；
f、向上述第三沉淀中加入适量高氯酸钠溶液，边搅拌边脱色1.5-2.5h，再用蒸馏水充分洗涤，得第四沉淀；
g、将上述第四沉淀于9500-12000rpm离心12-20min，获得第五沉淀；
h、将上述第五沉淀用乙酸溶液充分吹洗，再用蒸馏水充分洗涤，获得β-1，3-木聚糖。<...

【专利技术属性】
技术研发人员：张光亚，刘婷，葛慧华，
申请(专利权)人：华侨大学，
类型：发明
国别省市：福建;35