一种快速构建多价抗体表达载体的方法和试剂技术

本申请公开了一种快速构建多价抗体表达载体的方法和试剂。本申请方法包括，用化学合成的两端有酶切位点的抗体基因和连接肽基因组成的插入片段构建载体‑抗体基因‑linker‑1；采用定点突变，构建载体‑抗体基因‑linker‑2和载体‑抗体基因‑3，使三个克隆载体中，前一个克隆载体插入片段3’端酶切的黏末端与后一个载体插入片段5’端酶切的黏末端互补，使三个克隆载体酶切产物能依序相连；采用定点突变将预设的位于多价抗体表达载体两端的酶切位点加入表达载体骨架中，并将多价抗体表达载体接入表达载体骨架。本申请的方法，采用一种核酸内切酶，对所有片段统一进行酶切和连接，即可实现各片段有序连接，获得多价抗体表达载体，大大简化了多价抗体表达载体构建流程。

A method and reagent for rapid construction of multivalent antibody expression vector

The application discloses a method and a reagent for rapidly constructing a multivalent antibody expression vector. The method of the application includes: constructing the vector \u2011 linker \u2011 1 with the insertion fragment composed of the antibody gene with the enzyme cutting site at both ends and the connecting peptide gene; constructing the vector \u2011 linker \u2011 2 and the vector \u2011 antibody gene \u2011 3 with the site-specific mutation, so as to make the sticky end of the enzyme cutting at the 3 'end of the insertion fragment of the former and the latter of the three cloning vectors The 5 'end of the inserted fragment complements each other, so that the products of the three cloned vectors can be linked in sequence; the pre-set enzyme cutting sites at both ends of the multivalent antibody expression vector are added to the expression vector skeleton by site mutation, and the multivalent antibody expression vector is connected to the surface vector skeleton. The method of the application adopts a nucleic acid endonuclease to uniformly cut and connect all fragments, so as to realize orderly connection of each fragment and obtain a multivalent antibody expression vector, greatly simplifying the construction process of the multivalent antibody expression vector.

【技术实现步骤摘要】
一种快速构建多价抗体表达载体的方法和试剂
本申请涉及多价抗体制备领域，特别是涉及一种快速构建多价抗体表达载体的方法和试剂。
技术介绍
双价抗体(缩写BsAbs)的研究是从20世纪60年代开始的，多克隆血清中的两个不同抗原结合片段(Fabs)重新结合，形成双特异性F(ab')2分子。相比于天然的单特异性抗体，双价抗体识别同一或不同抗原上的两种不同的抗原表位。双价抗体，又称双特异性抗体，是含有两种特异性抗原结合位点的人工抗体，能在靶细胞和功能分子或功能细胞之间架起桥梁，激发具有导向性的免疫反应，是基因工程抗体的一种，它能够结合一个抗原的两个表位，或者结合两种抗原的表位。自然产生的抗体Fc域可以介导一系列的效应：ADCC、CDC、抗原呈递、FcRn-介导循环(长半衰期)等，而传统的重组单抗只能结合一个表位，且不能募集T细胞，因其不表达Fc受体，因而往往不能充分利用免疫系统的效应；然而双价抗体拥有两种特异性抗原结合位点，可以同时与靶细胞和功能细胞，一般为T细胞，相互作用，进而增强对靶细胞的杀伤作用。BsAbs以三功能抗体(Triomab)和双特本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速构建多价抗体表达载体的方法，其特征在于：包括以下步骤，/n载体-抗体基因-linker-1构建步骤，将化学合成的第一插入片段构建到载体上，所述第一插入片段由5’端至3’端依序包括第一酶切位点、抗体基因片段、连接肽基因片段、第二酶切位点，获得载体-抗体基因-linker-1；/n载体-抗体基因-linker-2构建步骤，以载体-抗体基因-linker-1为模板，采用定点突变技术，将所述第一插入片段5’端的第一酶切位点突变为所述第二酶切位点，将所述第一插入片段3’端的第二酶切位点突变为第三酶切位点，获得载体-抗体基因-linker-2；/n载体-抗体基因-3构建步骤，以载体-抗体基因-...

【技术特征摘要】
1.一种快速构建多价抗体表达载体的方法，其特征在于：包括以下步骤，
载体-抗体基因-linker-1构建步骤，将化学合成的第一插入片段构建到载体上，所述第一插入片段由5’端至3’端依序包括第一酶切位点、抗体基因片段、连接肽基因片段、第二酶切位点，获得载体-抗体基因-linker-1；
载体-抗体基因-linker-2构建步骤，以载体-抗体基因-linker-1为模板，采用定点突变技术，将所述第一插入片段5’端的第一酶切位点突变为所述第二酶切位点，将所述第一插入片段3’端的第二酶切位点突变为第三酶切位点，获得载体-抗体基因-linker-2；
载体-抗体基因-3构建步骤，以载体-抗体基因-linker-1或载体-抗体基因-linker-2为模板，采用定点突变技术，将所述第一插入片段5’端的酶切位点突变为第三酶切位点，并突变去除所述第一插入片段中的连接肽基因片段，同时将所述第一插入片段3’端的酶切位点突变为第四酶切位点，获得载体-抗体基因-3；
表达载体骨架改造步骤，以表达载体骨架为模板，采用定点突变技术在载体的多克隆位点序列中加入所述第一酶切位点和所述第四酶切位点，获得改造后的表达载体骨架；
所述第一酶切位点、第二酶切位点、第三酶切位点和第四酶切位点，能够被相同的II型核酸内切酶识别，并产生不同的粘性末端；
酶切连接步骤，采用所述II型核酸内切酶对载体-抗体基因-linker-1、载体-抗体基因-linker-2、载体-抗体基因-3和改造后的表达载体骨架进行酶切，并采用连接酶进行连接，获得pET28-抗体基因-linker-抗体基因-linker-抗体基因，即所述多价抗体表达载体。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述酶切连接步骤中，获得pET28-抗体基因-linker-抗体基因-linker-抗体基因，还包括将酶切连接产物转化大肠杆菌，挑取克隆进行鉴定，选择其中按照pET28-抗体基因-linker-抗体基因-linker-抗体基因顺序正确连接的克隆，即获得所述多价抗体表达载体。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述抗体基因片段为纳米抗体基因VHH。


4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述载体为pUC19，所述表达载体骨架为pET28。


5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述II型核酸内切酶为BsaI内切酶，所述第一酶切位点、第二酶切位点、第三酶切位点和第四酶切位点具有以下通式结构，
5’-GGTCTCN-3’
3’-CCAGAGNNNNN-5’
其中，N表示任意碱基，“GGTCTC”为BsaI内切酶的识别位点，酶切后形成四个碱基的粘性末端。


6.一种快速构建多价纳米抗体表达载体的试剂，其特征在于：包括第一突变引物组、第二突变引物组、第三突变引物组、第四突变引物组和第五突变引物组；
所述第一突变引物组和第二突变引物组分别用于对载体-抗体基因-linker-1中的第一插入片段进行酶切位点突变，将所述第一插入片段5’端的第一酶切位点突变为所述第二酶切位...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘楚新，杨乃波，曹丽霞，李秉睿，丁琪，
申请(专利权)人：深圳华大生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44