一种L-苏氨酸转醛酶在氟苯尼考手性中间体合成中的应用制造技术

本发明专利技术提供一种L‑苏氨酸转醛酶在氟苯尼考手性中间体合成中的应用，L‑苏氨酸转醛酶选择自下组中任意一种：(1)具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的多肽；(2)具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列≥90％同源性的多肽，且所述多肽具有催化活性；(3)将SEQ ID NO：1所示氨基酸序列经过1‑5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且保留催化活性的衍生多肽。本发明专利技术通过基因挖掘筛选到新的L‑苏氨酸转醛酶基因，采用基因工程手段表达重组大肠杆菌来源的L‑苏氨酸转醛酶，以对甲砜基苯甲醛和L‑苏氨酸为原料，通过全细胞催化反应合成(2S,3R)‑对甲砜基苯丝氨酸，在常温常压下通过一步反应便可获得氟苯尼考关键手性合成砌块，对环境友好，为一种绿色的生物合成途径。

Application of L-threonine transaldylase in the synthesis of florfenicol chiral intermediates

The invention provides an application of L-threonine transaminase in the synthesis of chiral intermediate of florfenicol. L-threonine transaminase is selected from any of the following groups: (1) polypeptide with amino acid sequence shown in SEQ ID No: 1; (2) polypeptide with amino acid sequence shown in SEQ ID No: 1 \u2265 90% homology, and the polypeptide has catalytic activity; (3) amino acid sequence shown in SEQ ID No: 1 A derivative peptide formed by substitution, deletion, or addition of 1 \u2011 5 amino acid residues and retaining catalytic activity. A new L-threonine transaminase gene is screened by gene mining, and the recombinant e.coli-derived L-threonine transaminase is expressed by means of gene engineering. With p-methylsulfonylbenzaldehyde and L-threonine as raw materials, the (2S, 3R) - p-methylsulfonylphenylserine is synthesized by whole cell catalytic reaction, and the key chirality of florfenicol can be obtained in one step under normal temperature and pressure Synthetic block, which is environmentally friendly, is a green biosynthetic pathway.

【技术实现步骤摘要】
一种L-苏氨酸转醛酶在氟苯尼考手性中间体合成中的应用
本专利技术属于生物技术和化学工程领域，具体涉及一种L-苏氨酸转醛酶在氟苯尼考手性中间体合成中的应用。
技术介绍
(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸是合成氟苯尼考的关键手性砌块。氟苯尼考是β-氨基醇类抗生素，具有吸收迅速、体内分布广泛，半衰期长，无再障副作用，不易产生耐药性，无残留，无交叉耐药性等优点，是替代氯霉素和甲砜霉素的新一代氯霉素类抗生素。主要用于治疗敏感细菌所致的猪、鸡、鱼的细菌性疾病和支原体感染，对畜禽大肠杆菌所引起的疾病，猪传染性胸膜肺炎、喘气病等疗效独特。近年来，我国氟苯尼考的生产和出口不断增长，2015年出口量约1744.4吨，同比增长21.18％，出口额同比增长39.51％，至2017年我国氟苯尼考的出口量已达到约2000吨，位列我国医药原料药年出口金额1亿美元以上的品种名单。目前，国内外工业生产(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸乙酯的主要方法是以对甲砜基苯甲醛和甘氨酸为原料，在硫酸铜和氨水存在的条件下，通过羟醛缩合反应生成对甲砜基苯丝氨酸，酯化得到对甲砜基苯丝氨酸乙酯，再经D-酒石酸拆分得到(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸。在得到对甲砜基苯丝氨酸乙酯生产过程中产生大量的硫酸铜废水，使得废水的处理成本很高。目前利用转醛酶合成对甲砜基苯丝氨酸的申请专利只有一件《一种制备手性(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸乙酯的方法》(申请公布号CN109836362A)，但是该专利技术申请的方案是利用纯酶进行反应，纯酶的生产成本高，反应时间长，而且该申请的说明书中记载反应所用的这种转醛酶是申请人自制的，无法查到关于该酶的相关文献报道、专利保护和市场销售信息，该申请人的官方网站上也无法购买到该酶，也即实际上本领域技术人员对于该专利技术申请所记载的技术方案是无法实现和验证的。综上所述，现在需要寻找一种适用的高效的L-苏氨酸转醛酶，针对氟苯尼考手性中间体(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸的催化合成过程，以降低生产成本、提高生产效率、减少环境污染。
技术实现思路
：本专利技术目的是提供一种L-苏氨酸转醛酶在氟苯尼考手性中间体合成中的应用，以及采用该L-苏氨酸转醛酶催化合成氟苯尼考手性中间体的方法步骤，要解决现有技术中所存在(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸的生产步骤繁琐、效率较低、生产成本高、环境污染大等技术问题。为实现以上目的，本专利技术采用如下技术方案：一种L-苏氨酸转醛酶在氟苯尼考手性中间体合成中的应用，所述L-苏氨酸转醛酶选择自下组中任意一种：(1)具有SEQIDNO：1所示氨基酸序列的多肽；(2)具有SEQIDNO：1所示氨基酸序列≥90％同源性的多肽，且所述多肽具有催化活性；(3)将SEQIDNO：1所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且保留催化活性的衍生多肽。优选的，所述L-苏氨酸转醛酶具有将对甲砜基苯甲醛和L-苏氨酸不对称催化合成(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸的催化活性。优选的，所述L-苏氨酸转醛酶为假单胞菌属(Pseudomonassp.)来源的LTTA基因编码，所述LTTA基因序列如SEQIDNO：2所示。优选的，所述对甲砜基苯甲醛和L-苏氨酸不对称催化合成(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸的反应体系包括：对甲砜基苯甲醛、L-苏氨酸、磷酸吡哆醛、氯化镁、L-苏氨酸转醛酶全细胞、反应缓冲液为含有10％乙酸乙酯(v/v)的Tris-HCl缓冲液(pH7.0)，15℃-30℃温度下反应12-24h。优选的，所述L-苏氨酸转醛酶为利用基因工程手段表达LTTA基因的重组大肠杆菌全细胞。优选的，反应体系中各原料的质量摩尔浓度之比为对甲砜基苯甲醛：L-苏氨酸：磷酸吡哆醛：氯化镁＝30：100：0.2：10，反应体系中所述重组大肠杆菌全细胞浓度为6.25mg/mL，Tris-HCl缓冲液(pH7.0)为100mM。优选的，所述重组大肠杆菌全细胞的制备方法包括：S1、构建包含有序列如SEQIDNO：2所示的LTTA基因的重组表达质粒载体；S2、将步骤S1中的重组表达质粒载体转化至大肠杆菌的感受态细胞中，37℃培养过夜后，在0.2mMIPTG、28℃下培养16h；S3、收集步骤S2中培养后的大肠杆菌菌体，即获得所述的L-苏氨酸转醛酶全细胞。优选的，所述L-苏氨酸转醛酶不对称催化合成(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸的反应体系的配置方法为：在反应容器中先加入Tris-HCl缓冲液(pH7.0)，然后分别称取对甲砜基苯甲醛、L-苏氨酸、磷酸吡哆醛和氯化镁并依次投入反应瓶中，充分混匀后，再加入重组大肠杆菌的全细胞，振荡反应。优选的，所述L-苏氨酸转醛酶不对称催化合成(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸的反应体系达到预定的反应时间后，将反应液在8000-10000rpm离心5-10min，除去细胞沉淀，收集的上清液即为含有(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸催化产物。本专利技术的方案至少具有以下有益效果：本专利技术通过基因挖掘筛选到新的L-苏氨酸转醛酶基因，采用基因工程手段表达重组大肠杆菌来源的L-苏氨酸转醛酶。L-苏氨酸转醛酶(EC2.1.2.1，LTTA)是磷酸吡哆醛(PLP)依赖型酶，能够直接催化不同的醛与L-苏氨酸反应，形成不对称C-C键，从而得到高附加值的β-羟基-α-氨基酸，在生物合成药物方面具有很好应用前景。本专利技术以廉价易得的对甲砜基苯甲醛为原料，直接采用L-苏氨酸转醛酶全细胞催化合成(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸，反应条件温和，反应时间短，在20℃下只需反应12h，目标产物(2S，3R)-对甲砜基苯丝氨酸的对映体过量ee>99.9％，非对映体过量de＝94.5％；而且以全细胞作为催化载体，不需要制备纯酶，节省了酶分离纯化、干燥等制备环节，大大降低了生产成本。传统的有机合成方法需要昂贵的金属催化剂，而且重金属污染严重，本专利技术采用生物催化方法取代化学合成法，在常温常压下通过一步反应便可获得氟苯尼考关键手性合成砌块(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸，同时产物对环境友好，是一种绿色生物合成方法。附图说明图1为实施例1中的L-苏氨酸转醛酶基因(GenBankNo.CVTX01000156)与已报道的L-苏氨酸转醛酶基因(Naturecommunications,2017,8:15935.)的相似性比对结果；图2为实施例1中通过SDS-PAGE检测重组大肠杆菌中的L-苏氨酸转醛酶蛋白的表达结果；图3为实验例2中不同底物对甲砜基苯甲醛浓度和细胞浓度对产物(2S，3R)-对甲砜基苯丝氨酸的转化率和de值的影响，其中：(A)底物浓度10mM，(B)底物浓度20mM，(C)底物浓度30mM，(D)底物浓度40mM；图4为实验例4中不同反应温度对产物(2S，3R)-对甲砜基苯丝氨酸的转化率和de值的影响；图5为实施例1中催化反应的产物(2S，3R)-对甲砜基苯丝氨酸的HPLC检测图本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种L-苏氨酸转醛酶在氟苯尼考手性中间体合成中的应用，其特征在于，所述L-苏氨酸转醛酶选择自下组中任意一种：/n(1)具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的多肽；/n(2)具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列≥90％同源性的多肽，且所述多肽具有催化活性；/n(3)将SEQ ID NO：1所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且保留催化活性的衍生多肽。/n

【技术特征摘要】
1.一种L-苏氨酸转醛酶在氟苯尼考手性中间体合成中的应用，其特征在于，所述L-苏氨酸转醛酶选择自下组中任意一种：
(1)具有SEQIDNO：1所示氨基酸序列的多肽；
(2)具有SEQIDNO：1所示氨基酸序列≥90％同源性的多肽，且所述多肽具有催化活性；
(3)将SEQIDNO：1所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且保留催化活性的衍生多肽。


2.根据权利要求1所述的L-苏氨酸转醛酶在氟苯尼考手性中间体合成中的应用，其特征在于，所述L-苏氨酸转醛酶具有将对甲砜基苯甲醛和L-苏氨酸不对称催化合成(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸的催化活性。


3.根据权利要求2所述的L-苏氨酸转醛酶在氟苯尼考手性中间体合成中的应用，其特征在于，所述L-苏氨酸转醛酶为假单胞菌属(Pseudomonassp.)来源的LTTA基因编码，所述LTTA基因序列如SEQIDNO：2所示。


4.根据权利要求3所述的L-苏氨酸转醛酶在氟苯尼考手性中间体合成中的应用，其特征在于，所述对甲砜基苯甲醛和L-苏氨酸不对称催化合成(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸的反应体系包括：对甲砜基苯甲醛、L-苏氨酸、磷酸吡哆醛、氯化镁、L-苏氨酸转醛酶全细胞、反应缓冲液为含有10％乙酸乙酯(v/v)的Tris-HCl缓冲液，15℃-30℃温度下反应12-24h。


5.根据权利要求4所述的L-苏氨酸转醛酶在氟苯尼考手性中间体合成中的应用，其特征在于，所述L-苏氨酸转醛酶为利用基因工程手段表达LTTA基因的重组大肠杆菌全细胞。


6.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：林娟，许炼，王力超，陈承滔，赖凌燕，
申请(专利权)人：福建昌生生物科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：福建;35