人流感嗜血杆菌表面蛋白单克隆抗体及应用制造技术

本发明专利技术提供了人流感嗜血杆菌表面蛋白单克隆抗体及人流感嗜血杆菌免疫层析检测试纸条。用重组的流感嗜血杆菌P6蛋白免疫Balb/c小鼠，得到一株分泌人流感嗜血杆菌表面蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株Hi‑17#，保藏编号CCTCC NO：C2017214；利用该细胞株分泌的单抗制备胶体金免疫层析试纸条，以杂交瘤细胞株Hi‑17#分泌的单抗作为标记单抗，以抗P6蛋白多克隆抗体作为包被抗体，获得的试纸条具有检测速度快，特异性高，灵敏度高，稳定性强，制作简便等特点。结果清晰易于判断，能高效辅助流感嗜血杆菌感染的临床诊断。

Monoclonal antibody against the surface protein of Haemophilus influenzae and its application

The invention provides a monoclonal antibody to the surface protein of Haemophilus influenzae and a test strip for immunochromatography detection of Haemophilus influenzae. BALB / c mice were immunized with recombinant Haemophilus influenzae P6 protein to obtain a hybridoma cell line hi \u2011 17 \u0dcf, which secreted monoclonal antibody against the surface protein of Haemophilus influenzae, with the preservation number of CCTCC No: c2017214. The monoclonal antibody secreted by the cell line hi \u2011 17 #, which was used as a marker monoclonal antibody, was used to prepare a colloidal gold immunochromatography strip As the coated antibody, the strip has the characteristics of fast detection speed, high specificity, high sensitivity, strong stability, and easy to make. Results it is clear and easy to judge, and can effectively assist the clinical diagnosis of Haemophilus influenzae infection.

【技术实现步骤摘要】
人流感嗜血杆菌表面蛋白单克隆抗体及应用
本专利技术属于免疫学领域，涉及一种人流感嗜血杆菌表面蛋白单克隆抗体、杂交瘤细胞株及应用。
技术介绍
流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae，Hi)简称流感杆菌，属嗜血杆菌属。本属细菌因人工培养时必须加新鲜血液或血液成分方能生长，故名嗜血杆菌。流感嗜血杆菌一般有六种菌株，称为a型、b型(又称乙型)、c型、d型、e型及f型。由流感嗜血杆菌自然产生的疾病只会在人类出现。在婴儿及孩童中，乙型流感嗜血杆菌会引致菌血病症及急性细菌性脑膜炎。偶尔地它会引致蜂窝组织炎、骨髓炎及关节感染。自从1990年开始，美国使用HiB结合型疫苗后，HiB病症的患病率减少至每十万名儿童有1.3名儿童感染。但是，HiB仍然是发展中国家引致婴儿及儿童下呼吸道疾病的主因。此外，没有荚膜的无分型流感嗜血杆菌亦会引致儿童的耳朵感染(如中耳炎)、眼睛感染(结膜炎)及鼻窦炎，并且联带肺炎，而该种菌株并无相应的疫苗应用。目前检测呼吸道中致病微生物的方法主要以传统方法为主，即分离鉴定法，该方法所需时间长，一般要2-3天，很难满足本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种产生人流感嗜血杆菌表面蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于：所述产生人流感嗜血杆菌表面蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株是由中国典型培养物保藏中心保藏的保藏号是保藏编号CCTCC NO：C2017214的杂交瘤细胞株Hi-17#。/n

【技术特征摘要】
1.一种产生人流感嗜血杆菌表面蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于：所述产生人流感嗜血杆菌表面蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株是由中国典型培养物保藏中心保藏的保藏号是保藏编号CCTCCNO：C2017214的杂交瘤细胞株Hi-17#。


2.一种产生人流感嗜血杆菌表面蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：
1)重组人流感嗜血杆菌P6蛋白的制备：
对人流感嗜血杆菌表面蛋白P6基因进行生物信息学分析，所述人流感嗜血杆菌表面蛋白P6的NCBI蛋白质数据库中的accessionnumber为WP_005652235，结合GC含量、密码子偏爱性、mRNA二级结构、RNA不稳定基序以及mRNA自由能稳定性，优化人流感嗜血杆菌表面蛋白P6的DNA编码序列，同时在人流感嗜血杆菌表面蛋白P6的DNA编码序列的5’引入酶切位点NdeI、在人流感嗜血杆菌表面蛋白P6的DNA编码序列的3’端引入终止信号TAA和酶切位点XhoI后化学合成全基因序列，所述化学合成的全基因序列连于载体pUC57上，记为P6’；将P6’按常规方法克隆入原核表达载体pET-28a(+)，以低温表达的方式，用IPTG诱导重组大肠杆菌表达，用Ni2+亲和层析法纯化可溶性重组人流感嗜血杆菌P6蛋白；
2)筛选抗人流感嗜血杆菌表面蛋白阳性杂交瘤细胞株：
a)制备免疫脾细胞：以步骤1)所制重组人流感嗜血杆菌P6蛋白为抗原，免疫8周龄的BALB/c小鼠5只，设2只不作免疫小鼠做阴性对照；初次免疫抗原加等量弗氏完全佐剂充分乳化后，背部皮下多点注射免疫小鼠，100μg/小鼠；之后间隔三周用相同剂量抗原与福氏不完全佐剂充分乳化后腹腔注射进行第二次免疫，以后间隔2周用相同剂量抗原与福氏不完全佐剂充分乳化后腹腔注射进行第三次免疫；第三次免疫15天后尾静脉采血，检测抗血清效价；取小鼠脾脏，用RPMI-1640洗液冲洗后，用吸有5mlRPMI-1640培养基注射器针头穿刺脾脏小心的洗出脾细胞，然后过筛，使脾细胞尽可能都通过网孔挤压到溶液中，将脾细胞悬液移入离心管中，1100rpm离心5min，弃上清，离心洗涤两次；用RPMI-1640培养液轻轻将脾细胞重悬，计数，备用；
b)细胞融合：将含1×108个脾细胞的悬液和含1×107个骨髓瘤细胞的悬液混合，补加培养基洗液至40ml，充分混匀；1200rpm离心5分钟，弃去上清；使细胞团块松散均匀呈糊状；取出已配好的50％PEG、RPMI-1640洗液，放在37℃水浴中，预温备用；所述PEG是MW1450；吸取50％的PEG0.8ml，缓慢加入离心管边加边搅拌，时间控制在60秒±5秒；然后再用60秒的时间逐渐加入40ml预热好的RPMI-1640洗液，使PEG稀释而失去促融作用；室温离心融合细胞，1000rpm离心5min，弃上清；加入HAT培养液，轻轻吹吸、重悬沉淀细胞；将融合细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔培养板内，50μl/孔，然后将培养板置37℃、5％CO2的培养箱中培养；
c)阳性克隆的筛选和克隆化培养：融合后第3天开始，每天观察各孔细胞生长情况，若有污染，立即用叠氮钠处理；融合后第7d用HT培养液全换液；换液后第二天，吸取出现克隆的孔上清用于特异性检测；将检测到有强阳性的孔，用有限稀释法进行亚克隆和克隆，经过3次克隆化操作后，所有的克隆化细胞孔检测阳性率为100％，即可确定已获得了分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。


3.一种人流感嗜血杆菌表面蛋白单克隆抗体，其特征在于：所述人流感嗜血杆菌表面蛋白单克隆抗体是由权利要求1所述的杂交瘤细胞株Hi-17#分泌的单克隆抗体。


4...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡征，
申请(专利权)人：湖北诺美华抗体药物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42