一种基于荧光的早期药物筛选方法技术

本发明专利技术涉及一种基于荧光的早期药物筛选方法。该方法包括以下步骤：步骤1）提供稳定表达离子通道靶点的目标细胞；步骤2）将电压敏感染料和具有不同浓度的所述药物与所述目标细胞一起孵育；步骤3）利用荧光测量装置测量孵育后的细胞的荧光基线值和随时间变化的数值；和步骤4）对所得的数值进行数据拟合，确定所述药物对所述离子通道靶点是具有激动作用或抑制作用。利用该方法，能够利用成本低廉的酶标仪来以中等通量对数十个离子通道靶点进行药物筛选，尤其适用于早期的药物筛选。

An early drug screening method based on fluorescence

The invention relates to an early drug screening method based on fluorescence. The method comprises the following steps: Step 1) providing a target cell stably expressing an ion channel target; step 2) incubating the voltage sensitive dye and the drug with different concentrations with the target cell; step 3) measuring the fluorescence baseline value and the value changing with time of the incubated cell with the fluorescence measuring device; and step 4) preparing the data of the obtained value And determining whether the drug has an exciting or inhibiting effect on the ion channel target. By using this method, we can use a low-cost enzyme labeling instrument to screen drugs with ten ion channel targets in medium flux, especially for early drug screening.

【技术实现步骤摘要】
一种基于荧光的早期药物筛选方法
本专利技术涉及药物筛选方法，特别涉及基于荧光的早期药物筛选方法。
技术介绍
离子通道是中枢神经系统活动的基础，与中枢神经系统的各种活动等密切相关，也是重要的药物筛选靶点。药物非特异性地作用于中枢神经系统离子通道，是药物中枢神经系统不良反应的主要原因。因此，药物对中枢神经系统的非特异性效应早期筛选，是中枢神经系统次级药理学筛选和安全药理学的重要内容，是新药研发过程中早期发现药物中枢神经系统毒性的重要工具。传统的中枢神经系统离子通道靶点筛选技术在毒性靶点筛选中，存在一定的缺陷，如膜片钳技术，虽然数据准确性较高，但是通量低，成本高，需要较强的技术背景，难以对数十个离子通道靶点同时进行筛选。荧光技术广泛应用于高通量筛选，成本低，但是经常需要昂贵的数据采集仪器(如FLIPR等)。而且一般针对一个靶点筛选大量的化合物，对于一个或几个化合物，筛选数十个性质不同的离子通道的作用靶点，仍然力不从心。另外，一些靶点(例如门控离子通道受体)存在多个亚型，且每个亚型还可能存在多个亚单元，这导致形成了大量的不同亚基组合的异构体，其分布、功能和药理学性质具有非常广泛的差异。因此，同时检测化合物对各个亚型的作用，也存在较大的困难。因此，本领域仍然需要一种快速、微量、高效且经济的、能够以中等通量同时对数十个离子通道靶点同时进行筛选的药物筛选方法，尤其在早期对药物进行有效筛选的方法。
技术实现思路
针对现有技术存在的不足，本专利技术的一个目的在于提供一种基于荧光的早期药物筛选方法。本专利技术的另一目的在于提供一种基于荧光的γ-氨基丁酸受体的早期药物筛选方法。上述目的通过以下方案来实现：在一方面，本专利技术提供一种基于荧光的药物筛选方法，所述方法包括以下步骤：步骤1)提供稳定表达离子通道靶点的目标细胞；步骤2)将电压敏感染料和具有不同浓度的所述药物与所述目标细胞一起孵育；步骤3)利用荧光测量装置测量孵育后的细胞的荧光基线值和随时间变化的数值；和步骤4)对所得的数值进行数据拟合，确定所述药物对所述离子通道靶点是具有激动作用或抑制作用。通过所述技术方案，能够以利用荧光测量来实现离子通道靶点的药物筛选。与传统检测检测方法手段如膜片钳等相比，根据该技术方案的方法进行的检测过程受外界影响因素较小，灵敏度较高。根据第一方面所述的药物筛选方法，优选地，所述离子通道靶点具有性能不同的多个亚型。进一步优选地，所述离子通道靶点为GABAA受体，其具有GABAα1～6六个亚型：α1β2γ2、α2β3γ2、α3β3γ2、α4β3γ2、α5β3γ2、α6β2γ2。通过所述技术方案，能够以中等通量同时对数十个离子通道靶点进行高效率筛选。根据第一方面所述的药物筛选方法，优选地，所述目标细胞为稳定表达GABAα1～6的HEK293细胞系。根据第一方面所述的药物筛选方法，优选地，所述电压敏感染料为细胞膜电位敏感染料。通过所述技术方案，在筛选过程中，能够用荧光检测细胞膜电位的变化，从而对药物进行筛选。根据第一方面所述的药物筛选方法，优选地，所述荧光测量装置为酶标仪。酶标仪具有检测灵敏度高、实用性强的特点。利用酶标仪，能够避免对昂贵的检测仪器如FLIPR荧光检测系统的需求，从而使本专利技术方法具有经济、高效等优点。根据第一方面所述的药物筛选方法，优选地，随着所述药物的浓度升高，所测量的荧光数值降低，则判断所述药物对所述离子通达靶点具有抑制作用。进一步优选地，随着所述药物的浓度升高，所测量的荧光数值升高，则判断所述药物对所述离子通达靶点具有激动作用。通过所述技术方案，根据所测量的荧光数值变化就能直观、快速地了解药物对所筛选的离子通道靶点是具有抑制或激动作用，并且检测的灵敏度高。在第二方面，本专利技术提供了一种基于荧光的γ-氨基丁酸受体的早期药物筛选方法，所述方法包括以下步骤：步骤1)提供稳定表达GABAα1～6的HEK293细胞系；步骤2)将电压敏感染料和具有不同浓度的所述药物与所述HEK293细胞系一起孵育；步骤3)利用荧光测量装置测量孵育后的HEK293细胞系的荧光基线值和随时间变化的数值；和步骤4)对所得的数值进行数据拟合，确定所述药物对所述GABAα1～6具有激动作用或抑制作用。根据第二方面所述的药物筛选方法，所述电压敏感染料为得自美国AAT公司的RedFluorescence膜电位检测试剂盒中包含的电压敏感染料。该细胞膜电压敏感染料能够进行一步检测，且具有廉价、免洗和快速灵敏的优点。通过上述技术方案，本专利技术获得了如下有益效果：1)与传统检测检测方法手段，如膜片钳等相比，根据本专利技术的方法的检测过程受外界影响因素较小；当细胞膜电位受外界刺激发生变化，即离子通道发生开合时，离子流进出导致的膜电位改变等，电压敏感染料也可以由激发光和发射光照射检测出这种变化值；2)根据本专利技术的筛选方法步骤少、简单、快速、可靠，需要的设备成本低廉，非常经济，并且能够以中等通量同时对数十个离子通道靶点同时进行筛选，效率高；3)根据实验所得的数据稳定，重复性好，适合推行到大规模高通量筛选技术；4)根据本专利技术的方法，在同一筛选系统中，通过基于荧光的中枢神经系统早期筛选技术，对所有可能靶点进行检测，进而筛选出先导化合物的次级靶标，避免后续研发过程中的一些不良反应及脱靶效应，这对于药物的筛选具有非常重大的意义。附图说明以下将结合附图来具体描述本专利技术的一些优选实施方式。本领域的普通技术人员将会理解，这些附图仅用于举例说明的目的，而无意于以任何方式来限制本专利技术的范围。图1显示在酶标仪上测量的GABA剂量依赖关系。该剂量依赖关系是利用膜电位检测试剂盒(ATT)在不同GABA浓度下测量的；图2显示酶标仪上检测的使用GABA的GABAA受体细胞系的EC50值：A:GABAα1β2γ2-HEK293，EC50＝14.85±4.33μM；B:GABAα2β3-HEK293，EC50＝7.40±0.92μM；C:GABAα3β3-HEK293，EC50＝1.53±0.47μM；D:GABAα4β3γ2-HEK293，EC50＝2.51±0.06μM；E:GABAα5β3-HEK293，EC50＝0.54±0.05μM；F:GABAα6β2γ2-HEK293，EC50＝0.50±0.23μM；图3显示在酶标仪上检测的使用Bicuculline的GABAA受体细胞系的EC50值：A:GABAα1β2γ2-HEK293，IC50＝14.29μM；B:GABAα2β3-HEK293，IC50＝24.99μM；C:GABAα3β3-HEK293，IC50＝5.92μM；D:GABAα4β3γ2-HEK293，IC50＝20.48μM；E:GABAα5β3-HEK293，IC50＝8.25μM；F:GABAα6β2γ2-HEK293，IC50＝8.52μM；图4A-H显示一系本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于荧光的早期药物筛选方法，所述方法包括以下步骤：/n步骤1）提供稳定表达离子通道靶点的目标细胞；/n步骤2）将电压敏感染料和具有不同浓度的所述药物与所述目标细胞一起孵育；/n步骤3）利用荧光测量装置测量孵育后的细胞的荧光基线值和随时间变化的数值；和/n步骤4）对所得的数值进行数据拟合，确定所述药物对所述离子通道靶点是具有激动作用或抑制作用。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于荧光的早期药物筛选方法，所述方法包括以下步骤：
步骤1）提供稳定表达离子通道靶点的目标细胞；
步骤2）将电压敏感染料和具有不同浓度的所述药物与所述目标细胞一起孵育；
步骤3）利用荧光测量装置测量孵育后的细胞的荧光基线值和随时间变化的数值；和
步骤4）对所得的数值进行数据拟合，确定所述药物对所述离子通道靶点是具有激动作用或抑制作用。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述离子通道靶点具有性能不同的多个亚型。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述离子通道靶点为GABAA受体，其具有GABAα1~6六个亚型：α1β2γ2、α2β3γ2、α3β3γ2、α4β3γ2、α5β3γ2、α6β2γ2。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目标细胞为稳定表达GABAα1~6的HEK293细胞系。


5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述电压敏感染料为细胞膜电位敏感染料。


6.根据权利要求1所述的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑双佳，魏成喜，张旭，赵明，李英骥，闫励，
申请(专利权)人：北京爱思益普生物科技股份有限公司，徐州爱思益普生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11