一种用于检测DMD基因外显子拷贝数变异的扩增系统及其试剂盒技术方案

本发明专利技术涉及一种用于检测人类DMD基因外显子拷贝数变异的扩增系统，包括检测10组外显子拷贝数变异相对应的扩增组合物，包含SEQ ID No.1至SEQ ID No.36所示的寡核苷酸序列，通过实时多重荧光定量PCR反应对人DMD基因外显子4、8、17、44、45、47、48、50、51、52这10个外显子目的片段进行扩增，根据检测结果判断人类DMD基因外显子有无缺失或重复突变，本发明专利技术还公开了其试剂盒。本发明专利技术的有益效果为：检测结果可实现DMD携带者、DMD患者与正常人的区分，结果可靠且重复性好，操作简单、设备要求低、试剂成本低廉，可覆盖DMD携带者或患者中90%左右的拷贝数变异，达到了检测覆盖度和检测外显子数量之间的良好平衡。

An amplification system and its kit for detecting copy number variation of exon of DMD gene

The invention relates to an amplification system for detecting the copy number variation of exons of human DMD gene, which includes the amplification composition corresponding to detecting the copy number variation of 10 groups of exons, including the oligonucleotide sequence shown in SEQ ID No.1 to SEQ ID No.36, and the 10 exons 4, 8, 17, 44, 45, 47, 48, 50, 51 and 52 of human DMD gene through real-time multi fluorescence quantitative PCR reaction The invention also discloses a kit thereof. The beneficial effect of the invention is that the detection result can realize the differentiation of DMD carriers, DMD patients and normal people, the result is reliable and repeatable, the operation is simple, the equipment requirements are low, the reagent cost is low, and it can cover about 90% of copy number variation in DMD carriers or patients, and achieve a good balance between the detection coverage and the number of detection exons.

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测DMD基因外显子拷贝数变异的扩增系统及其试剂盒
本专利技术涉及属于基因分子检测领域，具体来说，涉及一种用于检测DMD基因外显子拷贝数变异的扩增系统及其试剂盒。
技术介绍
杜氏/贝氏肌营养不良症(Duchenne/Beckmanmusculardystrophy；DMD/BMD)是DMD基因变异导致dystrophin蛋白缺陷所引起的一组遗传性疾病。临床表型包括：无症状高肌酸激酶血症、肌痉挛/肌痛、股四头肌肌病、X-连锁扩张型心肌病(X-linkeddilatedcardiomyopathy，XLDCM)等。DMD在男婴中的发病率约为1/3500-1/4000，多于5-6岁起病，表现走路慢，易摔倒，走路姿势异常，10-12岁左右不能行走，20-30岁死于心肺功能衰竭。BMD在男性中发病率约为1/8000-1/10000，临床症状出现较DMD晚，可保持行走能力到16岁，病情进展相对缓慢，寿命较长。儿童期或青年期BMD患者可表现为肌肉痛性痉挛肌痛或无症状高肌酶血症。女性DMD基因缺陷携带者临床表现差异较大，重者可为典型DMD表现，轻者表现为轻度近端肌无力、腓肠肌假性肥大，也可表现为肌肉功能基本正常。目前研究已确立杜氏/贝氏肌营养不良症的致病原因为DMD基因缺陷。DMD基因是至今已发现的最大的基因，定位于Xp21.2，包含80个外显子，8种启动子，2200000个碱基对。DMD基因所编码的Dystrophin蛋白分子量426kD，由3685个氨基酸组成，分为4个区域：1.氨基端区(14-240氨基酸)：跨越第1-8个外显子，与细胞内肌动蛋白(F-actin)相互作用；2.中央棒状区(253-3040氨基酸)：跨越9-63号外显子，由24个三聚螺旋状重复结构组成，每个重复结构由109个氨基酸组成，与α肌动蛋白(α-actin)和血影蛋白同源；3.富含半胱氨酸区域(3080-3360氨基酸)：跨越64-68外显子，与肌膜上糖蛋白复合体相互作用；4.羧基端区域(3361-3685氨基酸)：跨越68-79号外显子，与细胞内的syntrophins蛋白相互作用。Dystrophin蛋白连接细胞骨架与基底膜，并与其他蛋白(dystroglycan、sarcoglycan)形成dystrophin蛋白复合体以维持细胞膜稳定性。DMD基因的变异可破坏其mRNA开放读码框，严重影响dystrophin蛋白合成和功能，导致dystrophin蛋白复合体破坏，使肌细胞膜脆性增加、稳定性降低，强烈的肌肉收缩加剧肌细胞膜破裂，并使钙离子内流加速肌纤维的破坏，从而导致杜氏/贝氏肌营养不良症的临床表现。目前杜氏/贝氏肌营养不良症的临床治疗主要以保存患者运动功能、防治并发症为治疗目的，包括：糖皮质激素治疗、适当康复锻炼及外科矫形等。虽然在基因编辑、外显子跨越、PTC蛋白修复等治疗策略上取得重要进展，但目前尚无有效的根治方法，遗传阻断仍是最好的应对策略。进行DMD基因突变女性携带者筛查，并在产前行羊膜穿刺并对胎儿DMD基因突变进行检测，可确认男性胎儿是否遗传了母亲的DMD基因突变，从而达到遗传阻断的目的。DMD基因变异多样，主要包含4类；1：外显子拷贝数变异(CNV)，包括外显子缺失(deletion)和外显子重复(duplication)；2：外显子的点突变(substitution)；3：外显子的小插入和小缺失(indels)；4：未知变异(unknown)：主要是影响剪接的内含子突变。根据DMD专业数据库LOVD收录的DMD基因变异案例，上述各类变异的频率统计如下表：表1：DMD基因变异类型及相应比例变异类型DeletionDuplicationSubstitutionIndelsUnknown在所有变异中的比例56％11％31％0.7％1.3％在致病性变异中的比例66％12％20％0.9％1.1％从上述的DMD基因变异类型及相应比例中，可以得出结论，在DMD基因的致病性变异中，拷贝数变异占比达到78％左右，是导致杜氏/贝氏肌营养不良症的主要变异类型。目前临床上DMD基因的拷贝数变异检测多使用荷兰MRC公司生产的多重连接探针扩增(MultipleLigation-dependentProbeAmplification,MLPA)检测技术，DMD的MLPA检测试剂盒设计了P034探针组和P035探针组，其中P034探针组包括了用于检测DMD40个外显子的40对探针和9个内参基因的9对探针；P035探针组包括了用于检测DMD40个外显子的40对探针和8个内参基因的8对探针。每对探针与样本DNA杂交后，探针对中的两条探针首尾相连，在连接酶的作用下，可以连接成一条完整的DNA模板。P034的49对探针及P035的48对探针在完成连接后，使用通用引物进行PCR扩增，每个探针对连接产物扩增产生的PCR片段大小各不相同(每对探针中的两条探针5’端或3’端带有通用引物序列。使用填充序列使得PCR产物大小不一，产物大小为预先设定)，然后使用毛细管电泳进行片段筛选区分各个大小不同的PCR产物，根据PCR产物的长度(bp数)，判断扩增产物片段所代表的DMD外显子编号，根据DMD外显子PCR产物与内参基因PCR产物的丰度比率，判断DMD基因各外显子是否发生缺失或重复。DMD基因的MLPA检测技术具有良好的准确性，但是，MLPA检测技术试剂成本较高，片段筛选使用的毛细管电泳设备，如ABI3130或3500等，价格昂贵。另外，MLPA检测技术流程中环节较多，主要包括杂交过夜、探针连接、PCR扩增、片段筛选四个主要步骤，较多的环节对操作人员的实验技能及熟练程度提出了较高的要求，也增加了RQ值出现较大波动、样本编号出错的可能性。此外，DMD基因的拷贝数检测最有价值的应用是女性携带者筛查，这样，就需要进行大样本量检测，MLPA检测技术由于其技术环节较多，在应对大样本量的检测时具有一定的实际操作困难性。
技术实现思路
针对相关技术中的上述技术问题，本专利技术使用多重荧光定量PCR技术，对DMD基因的外显子缺失或重复进行定量检测。荧光定量PCR技术使用实时扩增中的△△Ct法进行拷贝数定量，较MLPA技术的片段扩增丰度相对比率定量具有更好的准确性；另外，所需主要设备仅为荧光实时PCR仪，设备价格远低于MLPA技术所使用的片段筛选设备，如ABI3130或3500等，便于检验机构或医院配置使用；此外，荧光定量PCR检测技术操作非常简单，实验者仅需在96孔板中加入样本DNA和反应混合液，即可上机运行并完成检测，因此，对实验者操作技能要求不高；易于获得稳定的检测结果；易于实现大样本筛选操作；且试剂成本低廉。尽管多重荧光定量PCR技术具有上述优势，但是，DMD基因的427m转录本具有79个外显子，如果对79个外显子都进本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测DMD基因外显子拷贝数变异的扩增系统，其特征在于：所述扩增系统包括10组外显子拷贝数变异检测相对应的扩增组合物；/n第一组扩增组合物包括第4外显子特异性上游引物SEQ ID No.1，第4外显子特异性下游引物SEQ ID No.2，第4外显子特异性探针SEQ ID No.3，和内参照组合物，所述内参照组合物包括内参照CFTR上游引物SEQ ID No.34，内参照CFTR下游引物SEQ ID No.35，内参照探针SEQ ID No.36；/n第二组扩增组合物包括第8外显子特异性上游引物SEQ ID No.4，第8外显子特异性下游引物SEQ ID No.5，第8外显子特异性探针SEQ ID No.6，和内参照组合物，所述内参照组合物包括内参照CFTR上游引物SEQ ID No.31，内参照CFTR下游引物SEQ ID No.32，内参照探针SEQ ID No.33；/n第三组扩增组合物包括第17外显子特异性上游引物SEQ ID No.7，第17外显子特异性下游引物SEQ ID No.8，第17外显子特异性探针SEQ ID No.9，和内参照组合物，所述内参照组合物包括内参照CFTR上游引物SEQ ID No.34，内参照CFTR下游引物SEQ ID No.35，内参照探针SEQ ID No.36；/n第四组扩增组合物包括第44外显子特异性上游引物SEQ ID No.10，第44外显子特异性下游引物SEQ ID No.11，第44外显子特异性探针SEQ ID No.12，和内参照组合物，所述内参照组合物包括内参照CFTR上游引物SEQ ID No.34，内参照CFTR下游引物SEQ ID No.35，内参照探针SEQ ID No.36；/n第五组扩增组合物包括第45外显子特异性上游引物SEQ ID No.13，第45外显子特异性下游引物SEQ ID No.14，第45外显子特异性探针SEQ ID No.15，和内参照组合物，所述内参照组合物包括内参照CFTR上游引物SEQ ID No.31，内参照CFTR下游引物SEQ ID No.32，内参照探针SEQ ID No.33；/n第六组扩增组合物包括第47外显子特异性上游引物SEQ ID No.16，第4外显子特异性下游引物SEQ ID No.17，第47外显子特异性探针SEQ ID No.18，和内参照组合物，所述内参照组合物包括内参照CFTR上游引物SEQ ID No.34，内参照CFTR下游引物SEQ ID No.35，内参照探针SEQ ID No.36；/n第七组扩增组合物包括第48外显子特异性上游引物SEQ ID No.19，第48外显子特异性下游引物SEQ ID No.20，第48外显子特异性探针SEQ ID No.21，和内参照组合物，所述内参照组合物包括内参照CFTR上游引物SEQ ID No.34，内参照CFTR下游引物SEQ ID No.35，内参照探针SEQ ID No.36；/n第八组扩增组合物包括第50外显子特异性上游引物SEQ ID No.22，第50外显子特异性下游引物SEQ ID No.23，第50外显子特异性探针SEQ ID No.24，和内参照组合物，所述内参照组合物包括内参照CFTR上游引物SEQ ID No.31，内参照CFTR下游引物SEQ ID No.32，内参照探针SEQ ID No.33；/n第九组扩增组合物包括第51外显子特异性上游引物SEQ ID No.25，第51外显子特异性下游引物SEQ ID No.26，第51外显子特异性探针SEQ ID No.27，和内参照组合物，所述内参照组合物包括内参照CFTR上游引物SEQ ID No.34，内参照CFTR下游引物SEQ ID No.35，内参照探针SEQ ID No.36；/n第十组扩增组合物包括第52外显子特异性上游引物SEQ ID No.28，第52外显子特异性下游引物SEQ ID No.29，第52外显子特异性探针SEQ ID No.30，和内参照组合物，所述内参照组合物包括内参照CFTR上游引物SEQ ID No.31，内参照CFTR下游引物SEQ ID No.32，内参照探针SEQ ID No.33。/n...

【技术特征摘要】
1.一种用于检测DMD基因外显子拷贝数变异的扩增系统，其特征在于：所述扩增系统包括10组外显子拷贝数变异检测相对应的扩增组合物；
第一组扩增组合物包括第4外显子特异性上游引物SEQIDNo.1，第4外显子特异性下游引物SEQIDNo.2，第4外显子特异性探针SEQIDNo.3，和内参照组合物，所述内参照组合物包括内参照CFTR上游引物SEQIDNo.34，内参照CFTR下游引物SEQIDNo.35，内参照探针SEQIDNo.36；
第二组扩增组合物包括第8外显子特异性上游引物SEQIDNo.4，第8外显子特异性下游引物SEQIDNo.5，第8外显子特异性探针SEQIDNo.6，和内参照组合物，所述内参照组合物包括内参照CFTR上游引物SEQIDNo.31，内参照CFTR下游引物SEQIDNo.32，内参照探针SEQIDNo.33；
第三组扩增组合物包括第17外显子特异性上游引物SEQIDNo.7，第17外显子特异性下游引物SEQIDNo.8，第17外显子特异性探针SEQIDNo.9，和内参照组合物，所述内参照组合物包括内参照CFTR上游引物SEQIDNo.34，内参照CFTR下游引物SEQIDNo.35，内参照探针SEQIDNo.36；
第四组扩增组合物包括第44外显子特异性上游引物SEQIDNo.10，第44外显子特异性下游引物SEQIDNo.11，第44外显子特异性探针SEQIDNo.12，和内参照组合物，所述内参照组合物包括内参照CFTR上游引物SEQIDNo.34，内参照CFTR下游引物SEQIDNo.35，内参照探针SEQIDNo.36；
第五组扩增组合物包括第45外显子特异性上游引物SEQIDNo.13，第45外显子特异性下游引物SEQIDNo.14，第45外显子特异性探针SEQIDNo.15，和内参照组合物，所述内参照组合物包括内参照CFTR上游引物SEQIDNo.31，内参照CFTR下游引物SEQIDNo.32，内参照探针SEQIDNo.33；
第六组扩增组合物包括第47外显子特异性上游引物SEQIDNo.16，第4外显子特异性下游引物SEQIDNo.17，第47外显子特异性探针SEQIDNo.18，和内参照组合物，所述内参照组合物包括内参照CFTR上游引物SEQIDNo.34，内参照CFTR下游引物SEQIDNo.35，内参照探针SEQIDNo.36；
第七组扩增组合物包括第48外显子特异性上游引物SEQIDNo.19，第48外显子特异性下游引物SEQIDNo.20，第48外显子特异性探针SEQIDNo.21，和内参照组合物，所述内参照组合物包括内参照CFTR上游引物SEQIDNo.34，内参照CFTR下游引物SEQIDNo.35，内参照探针SEQIDNo.36；
第八组扩增组合物包括第50外显子特异性上游引物SEQIDNo.22，第50外显子特异性下游引物SEQIDNo.23，第50外显子特异性探针SEQIDNo.24，和内参照组合物，所述内参照组合物包括内参照CFTR上游引物SEQIDNo.31，内参照CFTR下游引物SEQIDNo.32，内参照探针SEQIDNo.33；
第九组扩增组合物包括第51外显子特异性上游引物SEQIDNo.25，第51外显子特异性下游引物SEQIDNo.26，第51外显子特异性探针SEQIDNo.27，和内参照组合物，所述内参照组合物包括内参照CFTR上游引物SEQIDNo.34，内参照CFTR下游引物SEQIDNo.35，内参照探针SEQIDNo.36；
第十组扩增组合物包括第52外显子特异性上游引物SEQIDNo.28，第52外显子特异性下游引物SEQIDNo.29，第52外显子特异性探针SEQIDNo.30，和内参照组合物，所述内参照组合物包括内参照CFTR上游引物SEQIDNo.31，内参照CFTR下游引物SEQIDNo.32，内参照探针SEQIDNo.33。


2.根据权利要求1所述的扩增系统，其特征在于：所述各组扩增组合物中上游引物的工作液浓度为100-800nmol/L，所述各组扩增组合物中下游游引物的工作液浓度为100-800nmol/L，所述各组扩增组合物中特异性探针的工作液浓度为50-300nmol/L，所述内参照组合物中上游引物的工作液浓度为100-800nmol/L，所述内参照组合物中下游引物的工作液浓度为100-800nmol/L，所述内参照组合物中探针的工作液浓度为50-300nmol/L。


3.根据权利要求1所述的扩增系统，其特征在于：所述第一组扩增组合物外显子上游引物工作液浓度为400nmol/L，外显子下游引物工作液浓度为400nmol/L，外显子特异性探针工作液浓度为200nmol/L，所述内参照上游引物工作液浓度为400nmol/L，内参照CFTR下游引物工作液浓度为400nmol/L，内参照探针工作液浓度为200nmol/L。


4.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵立明，陈红星，韩磊，于超计，
申请(专利权)人：北京华瑞康源生物科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11