基因组DNA的提取方法、测序方法及试剂盒技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体涉及一种基因组DNA的提取方法、测序方法及试剂盒。所提供的提取方法包括(1)将待测样本和第一溶液混合，进行冷冻研磨，获得研磨样本，所述第一溶液包括异硫氰酸胍和巯基乙醇；(2)将所述研磨样本和第二溶液混合，提取、分离获得含有DNA的产物，所述第二溶液含有CTAB；(3)利用蛋白酶和RNA酶对所述含有DNA的产物进行消化处理，以便去除所述含有DNA的产物中的蛋白质和RNA；(4)对步骤(3)所获得的产物进行纯化处理，以便获得所述基因组DNA。应用该方法可以获得纯度高的DNA，所获得DNA满足三代测序的需求。

Extraction, sequencing and kit of genomic DNA

The invention relates to the field of biotechnology, in particular to a method for extracting genomic DNA, a sequencing method and a kit. The extraction method includes (1) mixing the sample to be tested with the first solution, performing freeze grinding to obtain the grinding sample, the first solution including guanidine isothiocyanate and mercaptoethanol; (2) mixing the grinding sample with the second solution, extracting and separating the product containing DNA, the second solution containing CTAB; (3) using protease and RNA enzyme to enter the product containing DNA Digestion is performed to remove the protein and RNA in the product containing DNA; and (4) purification is performed on the product obtained in step (3) to obtain the genomic DNA. With this method, high purity DNA can be obtained, which can meet the needs of three generations of sequencing.

【技术实现步骤摘要】
基因组DNA的提取方法、测序方法及试剂盒
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种基因组DNA的提取方法、测序方法及试剂盒。
技术介绍
土壤微生物群落是一个巨大的、相对未被开发的基因组多样性和代谢创新宝藏，它与陆地生态系统中的营养和能量流动密切相关。与栽培无关的环境基因组学，也被称为元基因组学，这种方法有望在高价值的治疗和生物量转化过程的通路重建和功能筛选方面获得前所未有的遗传信息。然而，由于难以获得足够高质量的高分子量DNA用于大规模插入文库的生产，土壤微生物群落仍然是一个挑战。近年来，高通量测序技术突飞猛进，极大地推动了全基因组测序工作的展开，全球已有数万种植物、动物及微生物完成了全基因组测序工作。第三代测序技术凭借着片段读长更长的优势在基因组研究中得到广泛应用。其中基于单分子蛋白纳米孔基因测序技术是新一代单分子实时测序技术，无需PCR，无需DNA合成，以单分子DNA(RNA)通过生物纳米孔的电流变化来确定其碱基组成。在充满电解液的腔内，带有纳米级小孔的绝缘防渗膜将腔体分成2个小室，当电压作用于电解液室，离子或其他小分子物质可穿过小孔，形成稳定的可检测的离子电流。掌握纳米孔的尺寸和表面特性、施加的电压及溶液条件，可检测不同类型的生物分子。由于组成DNA的四种碱基腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)的分子结构及体积大小均不同，单链DNA(ssDNA)在核酸外切酶的作用下被迅速逐一切割成脱氧核糖核苷酸分子，当单个碱基在电场驱使下通过纳米级的小孔时，不同碱基的化学性质差异导致穿越纳米孔时引起的电流的变化幅度不同，从而得到所测DNA的序列信息。样品主要要求指标为：样品溶液澄清无色，无不可溶解物质；电泳主带清晰，轻度降解，无蛋白、多糖及小片段污染，无RNA污染；样品A260/A280在1.8～2.0之间，A260/A230在2.0～2.2之间；样品NanoDrop所测浓度与Qubit所测浓度比值≤1.5；样品DNA总量≥10μg。土壤DNA目前已有的基因组仅限于第二代测序方法，植物的基因组DNA溶液含有大量色素，A260/230始终偏低，无法满足下游建库的要求。因此，特别需要快速的收集方法以及高效的DNA提取方法来解决这些技术困难，满足第三代测序的要求。由此，基因组DNA的提取方法还需要进一步改进，来满足第三代测序的需求。
技术实现思路
本专利技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本专利技术的一个目的在于提出一种基因组DNA的提取方法、测序方法及试剂盒。在对样本中的核酸提取，进行建库测序分析时，不同样本由于所含有的成分不同，在提取时会带来不同的难度。例如如果提取后的样本的DNA碎片较多，DNA片段的完整性不高，将不适宜进行三代测序。而从样本中所分离的基因组DNA的质量会影响到基因组文库的构建以及后续的测序结果。以土壤样本为例，在从土壤和/或其沉积物中提取高分子量、微生物群落基因组DNA的过程中，土壤中含有大量的色素等植物次生代谢产物，在提取基因组DNA的过程中很难去除。提取后DNA样本中含有的多糖多酚类的次生代谢产物，会对测序的酶反应的影响较高，所含有的色素也不利于高质量的文库的构建。而且通常为了获得高纯度的基因组DNA，需要利用酚、氯仿、异戊醇进行多次抽提，异丙醇沉淀，反复多次，操作复杂，而且用时很长。在一遍遍抽提纯化的过程中，使得DNA的提取得到很低，这样可能导致样本不能满足三代测序的最低起始量。同时如果所使用的有机物去除不彻底，残留在DNA中，也会影响到DNA的纯度和质量。因此，对于基因组DNA的提取方法或者提取工艺还需要进一步改进。本专利技术提供了一种基因组DNA的提取方法，该方法在对待测样本进行裂解时，采用含有异硫氰酸胍和巯基乙醇的变性液以及研磨处理，使得细胞的细胞壁和细胞膜受到机械(研磨)和化学处理从而裂解，裂解充分完全。然后利用含有CTAB的提取液提取分离基因组DNA，以保持高分子量基因组DNA的完整性。在去除蛋白质和RNA之后，纯化获得基因组DNA，所获得的基因组DNA，能够保持较好的完整性。具体而言，本专利技术提供了如下技术方案：在本专利技术的第一方面，本专利技术提供了一种基因组DNA的提取方法，包括：(1)将待测样本和第一溶液混合，进行冷冻研磨，获得研磨样本，所述第一溶液包括异硫氰酸胍和巯基乙醇；(2)将所述研磨样本和第二溶液混合，提取、分离获得含有DNA的产物；(3)利用蛋白酶和RNA酶对所述含有DNA的产物进行消化处理，以便去除所述含有DNA的产物中的蛋白质和RNA；(4)对步骤(3)所获得的产物进行纯化处理，以便获得所述基因组DNA。本专利技术所提供的基因组DNA的提取方法，其利用含有异硫氰酸胍、巯基乙醇的第一溶液对待测样本进行裂解和冷冻研磨，使得待测样本的细胞壁和细胞膜受到机械和化学处理，发生细胞裂解。然后利用含有CTAB的第二溶液进行提取处理，分离获得含有DNA的产物，利用蛋白酶和RNA酶去除其中的蛋白质和RNA，对所获得的产物进行纯化处理，所获得的基因组DNA，分子量具有很高的完整性，例如可以实现30M以上完整的DNA片段长度的筛选。而且DNA纯度高，含有的蛋白质和RNA杂质很少，以A260/A280和A260/A230测定结果为例，A260/A280在1.8～2.0之间，A260/A230在2.0～2.2之间，能够满足第三代测序的建库需求和测序需求。根据本专利技术的实施例，以上所述基因组DNA的提取方法可以进一步包括如下技术特征：在本专利技术的一些实施例中，所述第一溶液中所述异硫氰酸胍的使用浓度为3M～5M，优选为4M。第一溶液中异硫氰酸胍的使用浓度在3M～5M时，尤其是3.5M～4.5M之间时，所提取获得的基因组DNA的浓度A260/A280在1.8～2.0之间，A260/A230在2.0～2.2之间，DNA中所含有的蛋白质杂质和RNA杂质很少，纯度高，满足三代测序的需求。在本专利技术的一些实施例中，所述第一溶液还包括Tris-HCl和EDTA。在本专利技术的一些实施例中，步骤(4)中所述纯化处理包括：采用含有磁珠的混合液对步骤(3)所获得的产物进行纯化处理。通常在对所获得的DNA进行纯化时，采用酚、氯仿和异戊醇进行抽提，异丙醇进行沉淀，这种处理方法操作复杂，使用时间长，而且如果所用到的有机物去除不太彻底，会引起核酸纯度不够。通过含有磁珠的混合物对DNA进行纯化处理，能够有效获得高质量大片段的DNA，而且操作时间短，例如6小时就可以完成纯化处理过程，所获得的DNA纯度高，满足第三代建库和测序的需求。在本专利技术的一些实施例中，所述含有磁珠的混合液包括磁珠和磁珠缓冲液，所述磁珠缓冲液包括PEG8000和缓冲盐。在本专利技术的一些实施例中，所述磁珠缓冲液中PEG8000的使用浓度为10％～20％，优选为15％。PEG8000的使用浓度过高时，所获得的测序文库的出库量较高，但是由于PEG8000的浓度高，会吸附一些小片段，对测序的N50值会产生一些影响。PEG8000的使用浓度过低时，能够得到较长的D本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基因组DNA的提取方法，其特征在于，包括：/n(1)将待测样本和第一溶液混合，进行冷冻研磨，获得研磨样本，所述第一溶液包括异硫氰酸胍和巯基乙醇；/n(2)将所述研磨样本和第二溶液混合，提取、分离获得含有DNA的产物，所述第二溶液含有CTAB；/n(3)利用蛋白酶和RNA酶对所述含有DNA的产物进行消化处理，以便去除所述含有DNA的产物中的蛋白质和RNA；/n(4)对步骤(3)所获得的产物进行纯化处理，以便获得所述基因组DNA。/n

【技术特征摘要】
1.一种基因组DNA的提取方法，其特征在于，包括：
(1)将待测样本和第一溶液混合，进行冷冻研磨，获得研磨样本，所述第一溶液包括异硫氰酸胍和巯基乙醇；
(2)将所述研磨样本和第二溶液混合，提取、分离获得含有DNA的产物，所述第二溶液含有CTAB；
(3)利用蛋白酶和RNA酶对所述含有DNA的产物进行消化处理，以便去除所述含有DNA的产物中的蛋白质和RNA；
(4)对步骤(3)所获得的产物进行纯化处理，以便获得所述基因组DNA。


2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述第一溶液中所述异硫氰酸胍的使用浓度为3M～5M，优选为4M；
任选地，所述第一溶液还包括Tris-HCl和EDTA。


3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(4)中所述纯化处理包括：采用含有磁珠的混合液对步骤(3)所获得的产物进行纯化处理。


4.根据权利要求3所述的提取方法，其特征在于，所述含有磁珠的混合液包括磁珠和磁珠缓冲液，所述磁珠缓冲液包括PEG8000和缓冲盐。


5.根据权利要求4所述的提取方法，其特征在于，所述磁珠缓冲液中PEG8000的质量浓度为10％～20％，优选为15％；
任选地，所述磁珠缓冲液包括PE...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘晨，黄金，周荣芳，周晏秋，吴传文，田志坚，
申请(专利权)人：武汉华大基因技术服务有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42