一种酶解液、含其的试剂组合和提取试剂盒以及DNA提取方法技术

本发明专利技术公开了一种酶解液、含其的试剂组合和提取试剂盒以及DNA提取方法。其中，所述酶解液的pH值为7.8

【技术实现步骤摘要】
一种酶解液、含其的试剂组合和提取试剂盒以及DNA提取方法


[0001]本专利技术属于生物检测领域，具体涉及一种酶解液、含其的试剂组合和提取试剂盒以及DNA提取方法，尤其涉及一种宏基因组检测样本去宿主化并富集微生物的方法及试剂盒。

技术介绍

[0002]目前发展的三代测序(third
‑
generation sequencing，TGS)的典型特点便是单分子检测。当前获得较大认可的是PacBio公司开发的单分子实时测序(single Molecule Real
‑
time，SMRT)技术和ONT(Oxford Nanopore Technologies)公司开发的纳米孔单分子测序技术，三代测序以长读长为优势，实现了对碱基序列的实时读取，测序时间得以缩短。近十年，三代测序技术已成为研究者的首选。
[0003]ONT的纳米孔单分子测序技术，是第二个商业化的三代测序平台。与其他技术不同，纳米孔单分子测序技术基于电信号而非光信号。该技术的关键是设计一种特殊纳米孔，在DNA分子通过纳米孔的过程中实现测序。当DNA分子通过纳米孔时，电荷发生变化，从而短暂影响通过纳米孔的电流强度，每种碱基所影响的电流变化幅度不同，通过检测电流变化鉴定碱基。ONT测序的读长很长，理论上只要DNA分子足够长，纳米孔可以不停的对DNA分子进行测序。
[0004]现有技术对于长片段DNA提取未建立起粪便类特殊样本的长片段DNA提取流程，现有对于粪便样本提取所得核酸仅能满足扩增子及二代宏基因组建库，目前该类样本提取方法存在以下问题：
[0005]a)操作繁琐，部分试剂移液困难，提取效率较低；
[0006]b)现有技术提取获得的核酸片段长度偏低；
[0007]c)现有技术所采用的对应试剂盒为进口试剂，价格昂贵，采购周期长；
[0008]d)现有技术所提取的DNA样本无法第三代测序，其遗传信息的均一性差，导致建库成功率低；
[0009]基于此，期望获得一种可获得满足三代测序平台的长片段DNA提取方法及相关试剂，通过该提取方法提取得到DNA片段长度佳，纯度高，由此建库成功率高。

技术实现思路

[0010]为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种酶解液、含其的试剂组合和提取试剂盒以及DNA提取方法，该方法通过提取前处理以及适当的提取纯化步骤对粪便中的微生物进行大片段DNA提取，获得满足ONT建库测序要求的DNA。
[0011]为了实现上述目的，本专利技术通过以下几个方面实现：
[0012]第一方面，本专利技术提出了一种酶解液，所述酶解液的pH值为7.8
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8.2，其包含以下成分：
[0013]15
‑
25mM Tris
‑
HCl、2
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4mM EDTA、1％
‑
2％(v/v)Triton X
‑
100、0.2mol/L
‑
0.5mol/
L海藻糖以及10
‑
20mg/mL溶菌酶。
[0014]优选地，所述Tris
‑
HCl的浓度为20mM。
[0015]优选地，所述Triton X
‑
100的体积百分数为2％。
[0016]优选地，所述海藻糖摩尔浓度0.2mol/L。
[0017]优选地，所述溶菌酶为10mg/mL。
[0018]优选地，所述酶解液的pH值为8。
[0019]在本专利技术中，海藻糖可以有效的维持溶菌酶的活性，配合本专利技术中优选的15
‑
25mM Tris
‑
HCl缓冲液以及37℃左右的环境，可使海藻糖在溶菌酶周围形成海藻糖分子笼，在维持溶菌酶活性的同时可有效使变性溶菌酶复性，在2
‑
4mM EDTA、1％
‑
2％(v/v)Triton X
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100存在的条件下使整个体系中维持足够的微生物裂解能力同时有效避免了DNA降解的发生。溶菌酶在本专利技术所述的缓冲环境及反应条件下可以发挥较佳地作用。
[0020]第二方面，本专利技术提出了一种试剂组合，所述试剂组合包含上述的酶解液以及裂解液；
[0021]优选地，所述裂解液包含十二烷基硫酸钠，所述十二烷基硫酸钠的质量体积百分数为15％
‑
20％，其中质量体积百分比是指十二烷基硫酸钠占裂解液总体积的质量百分比。
[0022]优选地，所述试剂组合还包含抽提液。
[0023]更为优选地，所述抽提液包括第一抽提液以及第二抽提液，其中，所述第一抽提液包含苯酚、氯仿和/或异丙醇。
[0024]优选地，所述第一抽提液由苯酚、氯仿和异丙醇组成，所述苯酚、氯仿和异丙醇的体积配比为：25:24:1；所述苯酚优选Tris饱和酚。
[0025]优选地，所述第二抽提液包含氯仿和/或异丙醇，优选地，所述第二抽提液由氯仿以及异丙醇组成，所述氯仿和异丙醇的体积配比为24:1；所述苯酚优选Tris饱和酚。
[0026]第三方面，本专利技术提出了一种上述的酶解液或试剂组合在基因测序中的应用；优选地，所述基因测序为第三代测序。
[0027]在本专利技术所述的技术方案中，所述的试剂组合的制备方法包括如下步骤：
[0028]制备酶解液：根据酶解液的各组分配制，置于
‑
20℃保存；
[0029]制备裂解液：称取一定质量的十二烷基硫酸钠，采用灭菌水定容至一定体积，得到所需浓度的裂解液，室温保存。
[0030]优选地，当所述试剂组合包含第一抽提液以及第二抽提液时，所述制备方法还包括如下步骤：
[0031]第一抽提液配制：向250mL氯仿中加入240mLTris饱和酚以及10mL异戊醇后充分混匀，待静置超过8h液面出现明显分层后方可使用，使用时取下层液体；
[0032]第二抽提液配制：向500mL氯仿中加入21mL异戊醇后充分混匀，混匀后即可使用。
[0033]需要说明的是，在本专利技术所述的技术方案中，配置第一抽提液时，苯酚为Tris饱和酚，通过工艺制成，该溶液分为两层，上层溶液为0.1mol/ml Tris(pHw为8.0)，下层为Tris饱和酚，二者动态平衡。氯仿为三氯甲烷和异丙醇，均为市售分析纯试剂。
[0034]在本专利技术所述的技术方案中，苯酚和氯仿起到抽提作用，而异戊醇起消泡剂的作用。
[0035]第四方面，本专利技术提出了一种提取试剂盒，所述提取试剂盒包含上述的酶解液或
试剂组合。
[0036]第五方面，本专利技术提出了一种上述的提取试剂盒在基因测序中的应用。
[0037]本专利技术中所述基因测序例如为第三代测序。
[0038]第六方面，本专利技术提出了一种DNA提取方法，其包括如下步骤：
[0039]S1：向样本中添加上述的酶解液以及Rnase A、研磨并孵育；
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种酶解液，其特征在于，所述酶解液的pH值为7.8
‑
8.2，其包含：15
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25mM Tris
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HCl、2
‑
4mM EDTA、1％
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2％(v/v)Triton X
‑
100、0.2
‑
0.5mol/L海藻糖以及10
‑
20mg/mL溶菌酶。2.如权利要求1所述的酶解液，其特征在于，所述Tris
‑
HCl的浓度为20mM；和/或，所述Triton X
‑
100的体积百分数为2％；和/或，所述海藻糖摩尔浓度0.2mol/L；和/或，所述溶菌酶为10mg/mL；和/或，所述酶解液的pH值为8。3.一种试剂组合，其特征在于，所述试剂组合包含如权利要求1或2所述的酶解液，以及裂解液；优选地，所述裂解液包含十二烷基硫酸钠，所述十二烷基硫酸钠的质量体积百分数为15％
‑
20％。4.如权利要求3所述的试剂组合，其特征在于，所述试剂组合还包含抽提液；优选地，所述抽提液包含第一抽提液以及第二抽提液，其中：所述第一抽提液包含苯酚、氯仿和/或异丙醇；所述第一抽提液优选由苯酚、氯仿和异丙醇组成，所述苯酚、氯仿和异丙醇的体积配比优选25:24:1；所述苯酚优选Tris饱和酚；和/或，所述第二抽提液包含氯仿和/或异丙醇；所述第二抽提液优选由氯仿以及异丙醇组成，所述氯仿和异丙醇的体积配比优选24:1；所述苯酚优选Tris饱和酚。5.如权利要求1或2所述的酶解液或者如权利要求3或4所述的试剂组合在基因测序中的应用。6.一种提取试剂盒，其特征在于，所述提取试剂...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘群，宗亮，陈翠，江元，秦华峰，黄金，
申请(专利权)人：武汉华大基因技术服务有限公司，
类型：发明
国别省市：