一种多功能奶牛溶菌酶及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于生物工程领域，公开了一种利用原代奶牛乳腺上皮细胞生物反应器合成的多功能奶牛溶菌酶：包括奶牛溶菌酶、β

【技术实现步骤摘要】
一种多功能奶牛溶菌酶及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物工程领域，更具体地说，本专利技术涉及一种原代奶牛乳腺上皮细胞生物反应器合成的多功能奶牛溶菌酶及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]奶牛溶菌酶(LYZ)作为存在于奶牛体液及组织中的固有免疫因子，是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶，具有杀菌免疫功能。主要通过破坏细胞壁中的N
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乙酰胞壁酸和N
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乙酰氨基葡糖之间的β
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1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。奶牛溶菌酶除了具有传统的抗菌作用，还具有消化功能，存在于奶牛消化系统的溶菌酶含量远高于其他组织。奶牛溶菌酶在酸性环境中具有高构象稳定性，能抗胃蛋白酶(pepsin)的消化拆解，使其在酸性pH环境中具有最佳活性，在胃中消化分解细菌，消化成分被小肠吸收。
[0003]奶牛乳腺炎是奶牛常见病和多发病，随着奶牛乳腺炎发病率上升，大大降低奶牛产奶量，并严重影响原料奶质量。因此，奶牛乳腺炎的治疗越来越受重视。目前主要治疗手段是抗生素、中药制剂的药物治疗，而抗生素的使用，耐药菌株产生及乳中药物残留严重危害到消费者的健康，由于溶菌酶只作用于细菌细胞壁，又是生物体内天然的抗菌物质，对动物机体无毒无害，因此有望成为新型抗生素的替代品。
[0004]目前应用最广的溶菌酶为鸡蛋清溶菌酶，它在蛋清中含量丰富，抑菌功能显著，还具有易于提取，生产成本低等优点。但由于鸡蛋清溶菌酶会引起哺乳动物抗体介导的免疫应答反应，导致其应用领域大多局限于食品保鲜领域。与此同时人溶菌酶也被广泛的关注，但同样由于其对动物体的抗原异质性，导致目前主要应用在人体医学和食品工程领域。因此二者在兽药制备领域的应用鲜有报道，目前市场上还未发现利用鸡蛋清溶菌酶、人溶菌酶制备上市的兽药产品。溶菌酶是高等动物编码的蛋白，大肠杆菌或枯草芽孢杆菌表达的溶菌酶存在活性低、无法正确折叠以及形成不溶性包涵体等问题，因此现有溶菌酶的制备多采用真核表达系统——毕赤氏酵母。但是溶菌酶在毕赤氏酵母中表达后，最终产物与正常溶菌酶比较，会带上4个多余的氨基酸Glu、Ala、Glu和Ala，并与溶菌酶本身N
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端尾巴形成离子键，妨碍其功能的发挥，并且使蛋白容易形成淀粉状沉淀，从而大大降低溶菌酶的活性。此外，可以利用奶牛乳腺生物反应器制备溶菌酶，然而，相比于真核表达系统(毕赤氏酵母)，其制备成本较高。综上所述，筛选功能更加多样、应用更加广泛的新型重组溶菌酶，开发更高效的溶菌酶制备系统，具有重要的应用价值和广阔的市场前景，而奶牛溶菌酶由于其功能的多样性和动物的同源性，在兽药制备、医药开发、饲料加工、食品保鲜等多领域拥有重大的开发价值。

技术实现思路

[0005]本专利技术的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
[0006]本专利技术的另一个目的是提供一种多功能奶牛溶菌酶，其可同时满足兽药制备、医
药开发、饲料加工、食品保鲜等多个领域的应用需求，所述奶牛溶菌酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。所述多功能奶牛溶菌酶由原代奶牛乳腺上皮细胞生物反应器合成。
[0007]本专利技术的另一个目的是提供上述多功能奶牛溶菌酶的制备方法，在序列为SEQ ID NO:3的奶牛溶菌酶基因的5
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端插入牛乳蛋白启动子元件，在牛乳蛋白启动子元件3
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端插入β
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乳球蛋白肽基因序列，插入β
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乳球蛋白肽基因后的牛乳蛋白表达启动子元件序列如SEQ ID NO:2所示。
[0008]进一步的，采用携带增强型绿色荧光蛋白标签的哺乳细胞质粒为载体，将溶菌酶基因转染至原代乳腺上皮细胞中。
[0009]进一步的，所述原代奶牛乳腺上皮细胞生物反应器的制备方法为：采集泌乳奶牛新鲜乳腺组织，分离腺泡组织并传代培养，得到单细胞悬液，分离原代奶牛乳腺上皮细胞，作为原代奶牛乳腺上皮细胞生物反应器。
[0010]进一步的，培养奶牛乳腺上皮细胞过程中，根据成纤维细胞与乳腺上皮细胞二者贴壁速度的不同逐渐将成纤维细胞从乳腺上皮细胞中去除。
[0011]进一步的，传代培养40分钟后将含细胞的培养液更换一个培养瓶，留在老瓶内的多为成纤维细胞，如此经过4代得到纯化的原代乳腺上皮细胞。本专利技术还有一个目的是提供一种原代乳腺上皮细胞作为生物反应器在溶菌酶制备中的应用，具体的方法为：采用携带增强型绿色荧光蛋白标签的哺乳细胞质粒为载体，将溶菌酶基因转染至原代乳腺上皮细胞中，转染前在溶菌酶基因5
’
端插入牛乳蛋白表达启动元件序列，所述牛乳蛋白表达启动元件序列如SEQ ID NO:2所示。
[0012]本专利技术还有一个目的是提供一种多功能奶牛溶菌酶的应用，所述多功能奶牛溶菌酶应用于养殖业，具有多方面有益效果，一方面应用在兽药领域可作为防治奶牛乳腺炎的重要材料，另一方面作为饲料添加剂在猪饲料中添加，可在胃的酸性环境下消化分解细菌，消化成分被小肠吸收。用于食品保鲜，不仅具有高效的抑菌性能而且对可诱导人体对乳蛋白的口服免疫耐受，能够减轻尤其是消除牛乳蛋白过敏症的急性症状。
[0013]优选的是，采用携带增强型绿色荧光蛋白标签的哺乳细胞质粒为载体，将溶菌酶基因转染至原代乳腺上皮细胞中，转染前在溶菌酶基因5
’
端插入牛乳蛋白表达启动元件序列，所述牛乳蛋白表达启动元件序列如SEQ ID NO:2所示，所述的溶菌酶基因表达量可上调23202倍，溶菌酶可顺利分泌至原代乳腺上皮细胞外，且所制备的溶菌酶活性相比于传统毕赤氏酵母作为生物反应器可以显著提高。
[0014]本专利技术还提供上述多功能奶牛溶菌酶在制备动物抗菌药物或牛乳蛋白过敏药物中的应用。
[0015]本专利技术还提供上述多功能奶牛溶菌酶在奶牛乳腺炎防控中的应用。
[0016]优选的是，给药方式可通过静脉注射多功能奶牛溶菌酶的重组质粒组合物，也可直接乳房基部穿刺注射多功能奶牛溶菌酶。重组质粒可特异性在动物乳腺组织中表达所述奶牛溶菌酶，实现动物乳腺炎的预防或治疗，其中，所重组质粒复合物至少包含制备奶牛溶菌酶的重组质粒、F
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PEI(1mg/mL)(二者质量比为1:1)，使用1
×
PBS缓冲液将重组质粒复合物稀释至500μg/mL。
[0017]在患临床型乳腺炎的中国荷斯坦奶牛乳腺基部穿刺注射所述的奶牛溶菌酶，注射剂量为300μg/乳区，每48小时注射一次，注射3
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5次为一个疗程。
[0018]一种多功能奶牛溶菌酶在动物饲料制备中的应用。作为饲料添加剂在猪饲料中添加所述奶牛溶菌酶，所述奶牛溶菌酶可在胃中消化分解细菌，消化成分被小肠吸收。
[0019]优选的是，添加在猪饲料当中，可起到防腐的作用，又可在猪胃中消化分解细菌，消化成分被小肠吸收。
[0020]一种多功能奶牛溶菌酶在食品保鲜中的应用。
[0021]优选的是，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多功能奶牛溶菌酶，其特征在于，所述多功能奶牛溶菌酶由原代奶牛乳腺上皮细胞生物反应器合成，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。2.根据权利要求1所述的多功能奶牛溶菌酶的制备方法，其特征在于，在序列为SEQ ID NO:3的奶牛溶菌酶基因的5
’
端插入牛乳蛋白启动子元件，在牛乳蛋白启动子元件3
’
端插入β
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乳球蛋白肽基因序列，插入β
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乳球蛋白肽基因后的牛乳蛋白表达启动子元件序列如SEQ ID NO:2所示。3.根据权利要求2所述的多功能奶牛溶菌酶的制备方法，其特征在于，采用携带增强型绿色荧光蛋白标签的哺乳细胞质粒为载体，将溶菌酶基因转染至原代乳腺上皮细胞中。4.根据权利要求2所述的多功能奶牛溶菌酶的制备方法，其特征在于，所述原代奶牛乳腺上皮细胞生物反应器的制备方法为：采集泌乳奶...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨章平，张志鹏，杨奕，陈代杰，陈志，徐天乐，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：