一种人源溶菌酶蛋白基因、其表达载体的构建方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种人源溶菌酶蛋白基因、其表达载体的构建方法及其应用，本发明专利技术运用PTF102载体与经过玉米密码子优化后人工合成的人源溶菌酶基因片段进行连接，通过农杆菌介导的玉米幼胚转化实验获得了表达人源溶菌酶蛋白的独立转基因事件。通过对后代样本进行生化成分的分析，发现人源溶菌酶蛋白可以在胚乳中稳定的表达，并且能够在成熟籽粒的胚乳中积累。经过密码子优化后的人源溶菌酶蛋白具有抑菌活性，对革兰氏阳性菌有明显的抑菌作用，而对革兰氏阴性菌的抑制作用不明显。兰氏阴性菌的抑制作用不明显。兰氏阴性菌的抑制作用不明显。

【技术实现步骤摘要】
一种人源溶菌酶蛋白基因、其表达载体的构建方法及其应用


[0001]本专利技术涉及一种表达人源溶菌酶蛋白的玉米转基因材料的创制及其应用。
技术背景
[0002]溶菌酶(Lysozyme),又称胞壁质酶或N
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乙酰胞壁质聚糖水解酶,主要通过破坏细菌细胞壁肽聚糖中的N
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乙酰胞壁酸和N
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乙酰氨基葡糖之间的β
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1,4糖苷键,使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽,导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还可与带有负电荷的病毒蛋白直接结合,与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。溶菌酶还有许多其他功能，包括生殖、生长刺激、抗病毒、免疫调节、抗炎和抗肿瘤。因此,溶菌酶被广泛地应用于饲料、食品、临床医学、生物学等领域。
[0003]溶菌酶在家禽日粮中作为抗生素替代物参入饲料中，其优点是能够增强畜禽机体抵抗力和促进肠道有益菌的繁殖，且对人类和畜禽无毒副作用和无药害残留等。有研究表明，在饲料中添加一定量的溶菌酶添加剂，能够提高猪、鸡等畜禽的生长发育、繁殖性能，改善肉质，但其使用剂量受到限制。还有研究利用动物的乳腺生物反应器，构建人源溶菌酶表达载体，建立在乳汁中表达重组人源溶菌酶蛋白的转基因母猪，通过喂食乳汁，可以保护猪仔免受产肠毒素大肠杆菌的感染，改善猪仔的肠道性能。
[0004]玉米(Zea mays)是世界上产量最高的禾本科作物之一。除了作为粮食外，玉米还是畜禽重要的饲料来源，通过构建人源溶菌酶蛋白表达载体，借助农杆菌介导的玉米幼胚转化技术来获得转基因后代，进而分析一系列生理生化表现，以期获得具有抑菌活性的转基因玉米果穗意义重大。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的之一在于提供一种通过玉米密码子优化的人源溶菌酶蛋白基因。
[0006]本专利技术的目的之二在于提供含有该基因的表达载体及其构建方法。
[0007]本专利技术的目的之三在于提供一种表达人源溶菌酶蛋白的玉米转基因材料。
[0008]本专利技术的目的之四在于提供玉米转基因材料所表达的人源溶菌酶蛋白，该蛋白能产生抑菌活性，对革兰氏阳性菌有明显的抑制作用。
[0009]为达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0010]一种人源溶菌酶蛋白基因，是经过玉米密码子优化的人源溶菌酶蛋白基因，该基因为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；同时在优化后的溶菌酶基因序列前后两端分别加上了27kD
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γ
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醇溶蛋白的信号肽和内质网滞留信号。
[0011]SEQ ID NO.1的基因序列为：
[0012]tctagaATGAGGGTCCTCCTTGTGGCCCTTGCGCTTCTCGCGCTTGCCGCGTCTGCCACCTCTAAGGTGTTCGAGAGGTGCGAGCTGGCCCGCACCTTAAAGAGGCTCGGCATGGACGGCTACCGCGGCATGTCTCTTGCGAACTGGATGTGCCTCGCGAAGTGGGAGTCTGGCTACAACACCAGGGCGACCAACTACAACGCCGGCGACCGCAGTACCGACTACGGCATCTTCCAGATCAACTCTAGGTACTGGTGCAACGACGGCAAGACCCCTGGCGCCGTGAACGCCTGCCA
CCTCAGCTGCTCCGCGCTCCTTCAGGACAACATCGCGGACGCCGTGGCCTGCGCCAAGCGGGTCGTGAGGGACCCGCAGGGCATCCGGGCCTGGGTCGCGTGGAGGAACCGGTGCCAGAACCGGGACGTCAGGCAATATGTCCAGGGCTGCGGCGTCCACGACGAGCTTTGAAGAAACTATGTGCTGTAGTATAGCCGCTGGCTAGCTAGCTAGTTGAGTCATTTAGCGGCGATGATTGAGTAATAATGTGTCACGCATCACCATGGGTGGCAGTGTCAGTGTGAGCAATGACCTGAATGAACAATTGAAATGAAAAGAAAAAAGTATTTTCCAAAAAAAAAAAAAAAAAAgagctc。
[0013]一种本专利技术所述人源溶菌酶蛋白基因的表达载体的构建方法，采用PTF102作为转基因载体，将SEQ ID NO.1所示序列连入PTF102载体中获得人源溶菌酶蛋白基因的表达载体；其中PTF102载体经过改造，以玉米27kD
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γ
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醇溶蛋白启动子和终止子分别驱动和终止目的基因的表达。
[0014]一种本专利技术所述人源溶菌酶蛋白基因在构建人源溶菌酶蛋白的转基因植株的基因材料中的应用，采用玉米杂交品种PB
×
PA构建人源溶菌酶蛋白的转基因植株的基因材料。通过NCBI Primer
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blast设计特异性的鉴定引物，对表达人源溶菌酶蛋白的玉米转基因材料进行鉴定。
[0015]一种利用本专利技术所述人源溶菌酶蛋白基因构建表达人源溶菌酶蛋白的转基因玉米材料在抑制革兰氏阳性菌方面的应用，在玉米胚乳中表达人源溶菌酶蛋白，利用该蛋白调控革兰氏阳性菌的生长。
[0016]本专利技术涉及的表达人源溶菌酶蛋白的玉米转基因，基因序列如下：
[0017]tctagaATGAGGGTCCTCCTTGTGGCCCTTGCGCTTCTCGCGCTTGCCGCGTCTGCCACCTCTAAGGTGTTCGAGAGGTGCGAGCTGGCCCGCACCTTAAAGAGGCTCGGCATGGACGGCTACCGCGGCATGTCTCTTGCGAACTGGATGTGCCTCGCGAAGTGGGAGTCTGGCTACAACACCAGGGCGACCAACTACAACGCCGGCGACCGCAGTACCGACTACGGCATCTTCCAGATCAACTCTAGGTACTGGTGCAACGACGGCAAGACCCCTGGCGCCGTGAACGCCTGCCACCTCAGCTGCTCCGCGCTCCTTCAGGACAACATCGCGGACGCCGTGGCCTGCGCCAAGCGGGTCGTGAGGGACCCGCAGGGCATCCGGGCCTGGGTCGCGTGGAGGAACCGGTGCCAGAACCGGGACGTCAGGCAATATGTCCAGGGCTGCGGCGTCCACGACGAGCTTTGAAGAAACTATGTGCTGTAGTATAGCCGCTGGCTAGCTAGCTAGTTGAGTCATTTAGCGGCGATGATTGAGTAATAATGTGTCACGCATCACCATGGGTGGCAGTGTCAGTGTGAGCAATGACCTGAATGAACAATTGAAATGAAAAGAAAAAAGTATTTTCCAAAAAAAAAAAAAAAAAAgagctc
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63bp:内质网滞本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人源溶菌酶蛋白基因，其特征在于：是经过玉米密码子优化的人源溶菌酶蛋白基因，该基因为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；同时在优化后的溶菌酶基因序列前后两端分别加上了27kD
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γ
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醇溶蛋白的信号肽和内质网滞留信号。2.根据权利要求1所述人源溶菌酶蛋白基因，其特征在于：SEQ ID NO.1的基因序列为：tctagaATGAGGGTCCTCCTTGTGGCCCTTGCGCTTCTCGCGCTTGCCGCGTCTGCCACCTCTAAGGTGTTCGAGAGGTGCGAGCTGGCCCGCACCTTAAAGAGGCTCGGCATGGACGGCTACCGCGGCATGTCTCTTGCGAACTGGATGTGCCTCGCGAAGTGGGAGTCTGGCTACAACACCAGGGCGACCAACTACAACGCCGGCGACCGCAGTACCGACTACGGCATCTTCCAGATCAACTCTAGGTACTGGTGCAACGACGGCAAGACCCCTGGCGCCGTGAACGCCTGCCACCTCAGCTGCTCCGCGCTCCTTCAGGACAACATCGCGGACGCCGTGGCCTGCGCCAAGCGGGTCGTGAGGGACCCGCAGGGCATCCGGGCCTGGGTCGCGTGGAGGAACCGGTGCCAGAACCGGGAC...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋任涛，祁巍巍，陈璇，余坦特，
申请(专利权)人：上海大学，
类型：发明
国别省市：