一种从蛋清中提取高纯度溶菌酶的工艺方法技术

本发明专利技术公开了一种从蛋清中提取高纯度溶菌酶的工艺方法，提取步骤如下：S1：蛋清准备，选取蛋清200

【技术实现步骤摘要】
一种从蛋清中提取高纯度溶菌酶的工艺方法


[0001]本专利技术涉及生物工程
，具体为一种从蛋清中提取高纯度溶菌酶的工艺方法。

技术介绍

[0002]蛋清中的分子量为14300Da，等电点在10.7
‑
11.0之间，分子内含有4对S
‑
S键。能溶于水、不能溶于丙酮及乙醚的碱性蛋白质，晶体为为白色或者微白色的冻干粉，无臭、味甜。溶菌酶的化学性质十分稳定，pH值在1.2
‑
11.3范围内剧烈变化，结构几乎不变。该酶可以稳定存在于酸性环境中，pH＝3、96℃热处理15min后仍然能保持87％的酶活力，在碱性环境中，酶容易失活且热稳定性差。
[0003]溶菌酶在中性环境中的变性温度是77℃，所处的环境不同时，其变性温度也随之发生变化，当溶菌酶处于pH值小于1的环境中时，变性温度降至43℃，水溶液中的溶菌酶可以在不损失活性的情况下利用丙酮、乙醚及乙醇沉淀出来，表面活性剂如SDS等和碘等可抑制溶菌酶的活性；
[0004]蛋清中溶菌酶多与蛋清中其他大分子蛋白以复合体等形式存在，游离状态占比很小，直接提取势必造成溶菌酶的损失，蛋清前处理使溶菌酶游离出来是提高溶菌酶提取效率的关键步骤。蛋清粘性起主要作用的为卵黏蛋白，溶菌酶与卵黏蛋白通过静电力结合在一起，而葡萄糖氧化酶在有氧条件下能够降解多糖，从而降解卵黏蛋白，降低蛋清黏度使溶菌酶游离出来。
[0005]溶菌酶是一种碱性蛋白，PH＝7的中性环境下大部分蛋白带负电荷，而溶菌酶带正电荷，因此采用阳离子交换树脂可以针对性的分离出溶菌酶；同时针对溶菌酶分子量14300Da的特性设计截留量20K和10K的超滤膜，分别对树脂洗脱液进行除杂蛋白和浓缩除盐处理，浓缩后的液体经干燥处理，最终可得到纯度高、活力强的溶菌酶。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种从蛋清中提取高纯度溶菌酶的工艺方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
[0007]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种从蛋清中提取高纯度溶菌酶的工艺方法，提取步骤如下：
[0008]S1：蛋清准备，选取蛋清200
‑
300ml，进行蛋清预处理；
[0009]S2：D152树脂预处理，将D152树脂采用污水乙醇进行浸泡；
[0010]S3：树脂吸取，将D152树脂加入蛋清液中；
[0011]S4：树脂洗脱，采用氯化钠溶液进行洗脱；
[0012]S5：除杂蛋白，经过超滤膜去除大分子蛋白；
[0013]S6：除盐浓缩，经过超滤膜除去盐、水、小分子蛋白；
[0014]S7：溶菌酶制备，经过真空干燥制得溶菌酶。
[0015]优选的，基于提取步骤的S1中：
[0016]选取新鲜的鸡蛋，洗净后破壳吸取蛋清，吸取蛋清200
‑
300ml，并将蛋清置于烧杯中，加入葡萄糖氧化酶2
‑
3ml、30％浓度的H2O
2 4
‑
5ml。
[0017]优选的，基于提取步骤的S1中：
[0018]烧杯中加入葡萄糖氧化酶和过氧化氢溶液后，采用搅拌器对混合液进行搅拌，搅拌转速为500转/分钟，搅拌时间30分钟；
[0019]搅拌完成后将混合液经过100目滤网进行过滤，滤液置于4℃的冰箱中冷藏备用。
[0020]优选的，基于提取步骤的S2中：
[0021]在室温下，预先将D152树脂在无水乙醇中密封浸泡8小时，浸泡完成后，使用蒸馏水将D152树脂中的乙醇洗去。
[0022]优选的，基于提取步骤的S2中：
[0023]洗去乙醇的D152树脂加入质量分数为5％的氢氧化钠溶液进行浸泡，浸泡时间为8小时，浸泡完成后，使用蒸馏水进行清洗，直至树脂呈中性；
[0024]采用质量分数5％的HCl浸泡8小时，浸泡结束后，使用蒸馏水将D152树脂再次清洗至中性。
[0025]优选的，基于提取步骤的S3中：
[0026]取100mL蛋清液调pH至6.5
‑
7.5区间内，加入35mL的D152树脂，搅拌吸附，转速300转/分钟，吸附时间6.5h，弃上清液，并将上清液收集另用；
[0027]再加入相同体积的0.003mol/L的NaCl溶液搅拌洗脱1h，重复洗脱3次，合并滤出的洗脱液，测定酶浓度及酶比活力。
[0028]优选的，基于提取步骤的S4中：
[0029]树脂吸附后的蛋清，弃上清液，并将上清液收集另用，加入35ml0.003mol/L的NaCl溶液，进行搅拌，搅拌转速为100转/分钟，洗脱1h，洗脱3次，合并洗脱液。
[0030]优选的，基于提取步骤的S5中：
[0031]洗脱后，将洗脱液经过超滤膜进行过滤，超滤膜规格为20K
‑
50K，用于去除大分子蛋白，过滤后将滤液进行收集。
[0032]优选的，基于提取步骤的S6中：
[0033]滤液经过超滤膜进行二次过滤，二次过滤的超滤膜规格为3K
‑
10K，用于去除盐、水和小分子蛋白，将二次过滤的浓缩液进行收集。
[0034]优选的，基于提取步骤的S7中：
[0035]浓缩液经真空干燥，制备高纯度溶、高活力菌酶，制备溶菌酶活力大于20000U/mg，纯度为95
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98％。
[0036]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术向蛋清中添加一定量的葡萄糖氧化酶和过氧化氢使溶菌酶的解离释放、然后用H152弱阳性离子吸附树脂吸附、再用低浓度Nacl溶液洗脱、洗脱液经20K超滤膜超滤除蛋白和10K超滤膜浓缩去盐，最后浓缩液经真空干燥制备纯度高、活力强的溶菌酶。
附图说明
[0037]图1为本专利技术的工艺流程示意图。
具体实施方式
[0038]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0039]在本专利技术的描述中，需要说明的是，术语“上”、“下”、“内”、“外”“前端”、“后端”、“两端”、“一端”、“另一端”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本专利技术和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本专利技术的限制。此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
[0040]在本专利技术的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“设置有”、“连接”等，应做广义理解，例如“连接”，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种从蛋清中提取高纯度溶菌酶的工艺方法，其特征在于：提取步骤如下：S1：蛋清准备，选取蛋清200
‑
300ml，进行蛋清预处理；S2：D152树脂预处理，将D152树脂采用污水乙醇进行浸泡；S3：树脂吸取，将D152树脂加入蛋清液中；S4：树脂洗脱，采用氯化钠溶液进行洗脱；S5：除杂蛋白，经过超滤膜去除大分子蛋白；S6：除盐浓缩，经过超滤膜除去盐、水、小分子蛋白；S7：溶菌酶制备，经过真空干燥制得溶菌酶。2.根据权利要求1所述的一种从蛋清中提取高纯度溶菌酶的工艺方法，其特征在于：基于提取步骤的S1中：选取新鲜的鸡蛋，洗净后破壳吸取蛋清，吸取蛋清200
‑
300ml，并将蛋清置于烧杯中，加入葡萄糖氧化酶2
‑
3ml、30％浓度的H2O
2 4
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5ml。3.根据权利要求2所述的一种从蛋清中提取高纯度溶菌酶的工艺方法，其特征在于：基于提取步骤的S1中：烧杯中加入葡萄糖氧化酶和过氧化氢溶液后，采用搅拌器对混合液进行搅拌，搅拌转速为500转/分钟，搅拌时间30分钟；搅拌完成后将混合液经过100目滤网进行过滤，滤液置于4℃的冰箱中冷藏备用。4.根据权利要求1所述的一种从蛋清中提取高纯度溶菌酶的工艺方法，其特征在于：基于提取步骤的S2中：在室温下，预先将D152树脂在无水乙醇中密封浸泡8小时，浸泡完成后，使用蒸馏水将D152树脂中的乙醇洗去。5.根据权利要求4所述的一种从蛋清中提取高纯度溶菌酶的工艺方法，其特征在于：基于提取步骤的S2中：洗去乙醇的D152树脂加入质量分数为5％的氢氧化钠溶液进行浸泡，浸泡时间为8小时，浸泡完成后，使用蒸馏水进行清洗，直至树脂呈...

【专利技术属性】
技术研发人员：牛成明，胡顺营，赵锋祥，曹凤阳，苏永方，刘丽丽，
申请(专利权)人：山东恩诺基生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：