一种鸭肝炎病毒卵黄抗体ELISA检测方法技术

本发明专利技术公开了一种鸭肝炎病毒卵黄抗体ELISA检测方法，检测步骤如下：S1：扩毒，选用冻干种毒进行无菌稀释；S2：病毒液浓缩，将病毒液加入透析袋，进行浓缩；S3：病毒液灭活，取一半病毒液进行灭活处理；S4：卵黄液粗提取，在无菌环境下选取蛋清，抽取卵黄液；S5：捕获ELISA；S6：ELISA敏感性试验；S7：ELISA特异性试验；S8：ELISA重复性试验；S9：ELISA临床样品检测试验。本发明专利技术采用酶联免疫吸附试验，可对鸭肝炎病毒卵黄抗原抗体进行大通量、快速检测，可鸭肝炎卵黄抗体半成品、成品检测效率，有利于鸭肝炎卵黄抗体新的行业检测标准的形成。卵黄抗体新的行业检测标准的形成。

【技术实现步骤摘要】
一种鸭肝炎病毒卵黄抗体ELISA检测方法


[0001]本专利技术涉及生物工程
，具体为一种鸭肝炎病毒卵黄抗体ELISA检测方法。

技术介绍

[0002]鸭肝炎是由鸭肝炎病毒引起雏鸭的一种传播迅速和高度致死性传染病。主要特征为肝脏肿大，有出血斑点和神经症状。在新疫区，本病的死亡率很高，可达90％以上。给养鸭户们带来了严重的经济损失。注射鸭肝炎血清抗体能产生鸭肝炎卵黄抗体，也是预防鸭肝炎一种非常有效的措施。
[0003]经过海量检索，发现现有技术：公开号为CN104726409B，公开了一种永生化的鸭胚肝细胞系的制备方法，该方法包括：(1)用胰蛋白酶消化法消化鸭胚肝脏，培养该消化液，得到原代培养的鸭胚肝细胞；(2)采用脂质体转染法，将编码hTERT和Marker基因的真核表达质粒导入该原代培养的鸭胚肝细胞；(3)培养该转染的鸭胚肝细胞，用G418筛选该hTERT阳性克隆；(4)培养筛选的该hTERT阳性克隆，连续培养超过50代次，得到永生化的细胞系。该细胞系在体外传代50代以上仍有较好的活力，保持分裂增殖，不发生衰老和凋亡，是一种永生化的细胞系。该永生化的鸭胚肝细胞形态规则，培养条件简单、容易控制，使用方便，为研究鸭病，特别是研究鸭肝炎病毒提供了很好的载体。
[0004]综上所述，鸭肝炎病毒抗体的检测主要为中和试验方法，该方法费时费力，且检测结果不够稳定准确。同时，行业内的检测方法，主要针对鸭源抗体的检测，而随着鸡源卵黄抗体产品的持续发展，进一步开发方便、快捷、稳定性好的、专门用于卵黄抗体检测方法显得尤为必要。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种鸭肝炎病毒卵黄抗体ELISA检测方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种鸭肝炎病毒卵黄抗体ELISA检测方法，检测步骤如下：
[0007]S1：扩毒，选用冻干种毒进行无菌稀释；
[0008]S2：病毒液浓缩，将病毒液加入透析袋，进行浓缩；
[0009]S3：病毒液灭活，取一半病毒液进行灭活处理；
[0010]S4：卵黄液粗提取，在无菌环境下选取蛋清，抽取卵黄液；
[0011]S5：捕获ELISA；
[0012]S6：ELISA敏感性试验；
[0013]S7：ELISA特异性试验；
[0014]S8：ELISA重复性试验；
[0015]S9：ELISA临床样品检测试验。
[0016]优选的，基于检测步骤的S1中：
[0017]取冻干种毒1
‑
4E5，加1mL无菌PBS复溶，旋涡混匀10秒以上，倍比稀释1000倍稀释至10mL，放置在冰盒上，按照0.1mL/枚剂量，尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚90枚，收获24h后死亡鸡胚尿囊液及胚体，匀浆冻融2次，离心取上清，加入终浓度1000UI/mL双抗，充分混匀，500mL分装
‑
80℃保存备用；
[0018]取湿毒1
‑
5E81支，融化后旋涡混匀，以无菌PBS梯度稀释至100倍稀释至10mL，充分混匀后，放置在冰盒上，按照0.1mL/枚剂量尿囊腔接种11日龄鸭胚，接种90枚，收获24h后死亡鸭胚尿囊液及胚体，匀浆冻融2次，离心取上清，加入终浓度1000UI/mL双抗，充分混匀，500mL分装
‑
80℃保存备用。
[0019]优选的，基于检测步骤的S2中：
[0020]将病毒液加入透析袋中封口，加入PEG20000覆盖4℃过夜进行10倍浓缩。浓缩液进行病原测定，确定为单一病原；
[0021]基于检测步骤的S3中：
[0022]取一半病毒液加入10％甲醛溶液使其终浓度为0.05％，加甲醛溶液后37℃密封灭活24小时，其间每隔4～6小时摇晃一次，灭活后，置于2～8℃保存备用，并取样用于无菌检测。
[0023]优选的，基于检测步骤的S4中：
[0024]在无菌条件下将蛋清倒出，将卵黄膜刺破，抽取约卵黄液，加入1倍灭菌PBS充分震荡摇匀后，复加入2倍体积的氯仿充分震荡摇匀，离心3000r/min，15min。
[0025]优选的，基于检测步骤的S5中：捕获步骤如下：
[0026]a：用包被液稀释抗体至工作浓度，每孔100uL加入到96孔酶标板中，4℃放置15h，弃去孔中包被液，用洗涤液洗3次，每次5min，在吸水纸上拍干；
[0027]b：每孔加入封闭液200uL，37℃温育1h，弃去孔中封闭液，洗涤液洗3次，每次5min，在吸水纸上拍干；
[0028]c:每孔加入用PBS稀释至工作浓度的捕获抗原100uL，37℃/室温温育，弃去孔中溶液，用洗涤液洗3次，每次5min，在吸水纸上拍干；
[0029]d:每孔加入稀释的被检卵黄100uL，37℃/室温温育，弃去孔中溶液，用洗涤液洗3次，每次5min，在吸水纸上拍干；
[0030]e：每孔加入100uL稀释的羊抗鸡二抗，采用HRP标记，37℃/室温温育，弃去孔中溶液，用洗涤液洗3次，每次5min，在吸水纸上拍干；
[0031]f：每孔加入TMB底物液100uL，室温避光10min，每孔加入终止液50uL终止反应，在酶标仪测OD450值。
[0032]优选的，基于检测步骤的S6中：
[0033]将鸭肝炎阳性蛋黄分别进行1:10、1:50、1:100、1:200、1:500、1:1000、1:2000、1:3000、1:4000、1:5000、1:10000倍系列稀释，以各稀释度进行ELISA检测，确定对鸭肝炎阳性样品的最低检出效价。
[0034]优选的，基于检测步骤的S7中：
[0035]分别选取已知的鸭肝炎阳性卵黄和阴性卵黄、小鹅瘟、鹅星状病毒、鸭圆环病毒阳性卵黄抗体，利用ELISA方法依次进行检测，确定该检测方法的特异性。
[0036]优选的，基于检测步骤的S8中：
[0037]批内重复性试验：用同一批次包被的4块ELISA板，分别在4个不同时间点对4份鸭肝炎抗体水平不同的蛋黄样品进行检测，统计检测结果并计算变异系数，确定该ELISA方法的批内重复性；
[0038]批间重复性试验：用不同批次制备的4批包被的ELISA反应板，并分别在4个不同时间点对4份鸭肝炎抗体水平不同的蛋黄样品进行检测，统计检测结果并计算变异系数，确定该ELISA方法的批间重复性。
[0039]优选的，基于检测步骤的S9中：
[0040]分别用本试验所建立的ELISA方法和中和试验对同一批蛋样进行检测所建立的ELISA方法的临床适用性。
[0041]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术采用酶联免疫吸附试验，可对鸭肝炎病毒卵黄抗原抗体进行大通量、快速检测，可鸭肝炎卵黄抗体半成品、成品检测效率，有利于鸭肝炎卵黄抗体新的行业检测标准的形成。
具体实施方式
[0042]下面将结合本专利技术实施例，对本本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鸭肝炎病毒卵黄抗体ELISA检测方法，其特征在于：检测步骤如下：S1：扩毒，选用冻干种毒进行无菌稀释；S2：病毒液浓缩，将病毒液加入透析袋，进行浓缩；S3：病毒液灭活，取一半病毒液进行灭活处理；S4：卵黄液粗提取，在无菌环境下选取蛋清，抽取卵黄液；S5：捕获ELISA；S6：ELISA敏感性试验；S7：ELISA特异性试验；S8：ELISA重复性试验；S9：ELISA临床样品检测试验。2.根据权利要求1所述的一种鸭肝炎病毒卵黄抗体ELISA检测方法，其特征在于：基于检测步骤的S1中：取冻干种毒1
‑
4E5，加1mL无菌PBS复溶，旋涡混匀10秒以上，倍比稀释1000倍稀释至10mL，放置在冰盒上，按照0.1mL/枚剂量，尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚90枚，收获24h后死亡鸡胚尿囊液及胚体，匀浆冻融2次，离心取上清，加入终浓度1000UI/mL双抗，充分混匀，500mL分装
‑
80℃保存备用；取湿毒1
‑
5E81支，融化后旋涡混匀，以无菌PBS梯度稀释至100倍稀释至10mL，充分混匀后，放置在冰盒上，按照0.1mL/枚剂量尿囊腔接种11日龄鸭胚，接种90枚，收获24h后死亡鸭胚尿囊液及胚体，匀浆冻融2次，离心取上清，加入终浓度1000UI/mL双抗，充分混匀，500mL分装
‑
80℃保存备用。3.根据权利要求1所述的一种鸭肝炎病毒卵黄抗体ELISA检测方法，其特征在于：基于检测步骤的S2中：将病毒液加入透析袋中封口，加入PEG20000覆盖4℃过夜进行10倍浓缩。浓缩液进行病原测定，确定为单一病原；基于检测步骤的S3中：取一半病毒液加入10％甲醛溶液使其终浓度为0.05％，加甲醛溶液后37℃密封灭活24小时，其间每隔4～6小时摇晃一次，灭活后，置于2～8℃保存备用，并取样用于无菌检测。4.根据权利要求1所述的一种鸭肝炎病毒卵黄抗体ELISA检测方法，其特征在于：基于检测步骤的S4中：在无菌条件下将蛋清倒出，将卵黄膜刺破，抽取约卵黄液，加入1倍灭菌PBS充分震荡摇匀后，复加入2倍体积的氯仿充分震荡摇匀，离心3000r/min，15min。5.根据权利要求1所述的一种鸭肝炎病毒卵黄抗体ELISA检测方法，其特征在于：基于检测步骤的S5中：捕获步骤如下：a：用包被液稀...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵锋祥，牛成明，胡顺营，曹凤阳，王丙敬，苏永方，刘丽丽，
申请(专利权)人：山东恩诺基生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：