一种利用离子液体提取鸡蛋中溶菌酶的方法技术

本发明专利技术属于溶菌酶的分离提取技术领域，具体涉及一种利用离子液体提取鸡蛋中溶菌酶的方法。包括下述步骤：(1)对蛋清进行过滤，并将所得滤液与水均匀混合，得到蛋清溶液；(2)调节所述蛋清溶液的pH至4.5，水浴加热；(3)对经步骤(2)处理所得反应液进行离心，收集所得上清液，冷冻干燥，得到蛋清粉；(4)将所述蛋清粉溶于离子液体水溶液中，离心，除去不溶物；(5)采用悬滴法，使步骤(4)除去不溶物后所得液体在沉淀剂和缓冲液存在的条件下结晶，所得晶体即为溶菌酶。本发明专利技术可使蛋清在较低的浓度下不受复杂基质的影响，实现从蛋清中结晶溶菌酶，得到的晶体尺寸大、晶型好、纯度高且生物活性强。纯度高且生物活性强。纯度高且生物活性强。

【技术实现步骤摘要】
一种利用离子液体提取鸡蛋中溶菌酶的方法


[0001]本专利技术属于溶菌酶的分离提取
，具体涉及一种利用离子液体提取鸡蛋中溶菌酶的方法。

技术介绍

[0002]作为分离纯化蛋白的重要手段，蛋白质结晶学不仅精简了蛋白质纯化的步骤，还有效降低了生物制药方面的成本。之后出现的X
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射线衍射技术使蛋白质结晶有了新的应用领域，也使得结晶技术成为研究生物大分子性质和功能作用的重要基础，而培养适合衍射分析的晶体是制约这一领域发展的瓶颈。因此研究蛋白质结晶过程的机理，改进结晶技术和改善结晶条件对培养出适合衍射分析的晶体具有重要意义。
[0003]鸡蛋溶菌酶是溶菌酶的典型代表，也是目前了解最多、研究最广泛的溶菌酶之一。由于鸡蛋白溶菌酶性质稳定，结晶条件比较温和，晶体生长时间相对较短，而且试剂廉价易得，因此在大多数情况下被作为模型蛋白来进行晶体学的探索研究。结晶法是制备鸡蛋溶菌酶常用和理想的方法之一，其得到的溶菌酶晶体纯度高，且能最大程度保留溶菌酶的活性。蛋清中蛋白质种类众多，含量最高的蛋白质是卵清蛋白，而溶菌酶仅为3.5％，所以蛋清中的溶菌酶直接结晶较为困难。目前最常用的方法是在蛋清中加入食盐，使其盐浓度为5％左右，调节溶液的pH值在溶菌酶的等电点10.5附近，加入少许溶菌酶晶种作为晶核诱导结晶，于冰箱中4℃条件下冷却数天，即可得到溶菌酶晶体。这种方法需要引入外来晶种，得到的晶体尺寸较小、多为微晶，且时间较长。
[0004]离子液体具有呈液态的温度区间大、几乎无蒸气压、不易挥发、对有机化合物、无机化合物以及生物大分子蛋白质和核酸均有较好的溶解度，因此非常适合作为分离提纯的试剂。近些年，离子液体被引入到蛋白质的结晶研究中，无论是作为添加剂或是沉淀剂，其在蛋白质结晶中能够提高晶体质量、改善晶体晶型和结构、优化结晶过程、影响晶体形态等，得到比常规结晶更为理想的结晶效果。
[0005]目前已有的采用离子液体研究蛋白质结晶的报道中，采用的都是纯度较高的鸡蛋白溶菌酶，研究的主要是离子液体对晶体晶型的调控方面；而尚未见到将离子液体直接用于实际复杂样品中蛋白质的结晶。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种利用离子液体提取鸡蛋中溶菌酶的方法，以解决或改善现有技术从鸡蛋中提取溶菌酶时需要引入溶菌酶晶种，提取得到的溶菌酶的晶体尺寸小、时间长中的至少一项问题。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种利用离子液体提取鸡蛋中溶菌酶的方法，包括下述步骤：(1)对蛋清进行过滤，并将所得滤液与水均匀混合，得到蛋清溶液；(2)调节所述蛋清溶液的pH至4.5，水浴加热；(3)对经步骤(2)处理所得反应液进行离心，收集所得上清液，冷冻干燥，得到蛋清粉；(4)将所述蛋清粉溶于离子液体水溶液中，离
心，除去不溶物；(5)采用悬滴法，使步骤(4)除去不溶物后所得液体在沉淀剂和缓冲液存在的条件下结晶，所得晶体即为溶菌酶。
[0008]优选地，步骤(2)中，所述水浴加热的温度为95
‑
100℃，时间为80
‑
120s。
[0009]优选地，步骤(3)中，离心的速度为8000
‑
12000rpm，离心时间为4
‑
6min。
[0010]优选地，步骤(3)中，冷冻干燥的时间为24h以上。
[0011]优选地，步骤(4)中，离心的速度为8000
‑
12000rpm，离心时间为8
‑
12min。
[0012]优选地，步骤(5)中，所述沉淀剂为NaCl溶液，所述缓冲液为NaAc
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HAc缓冲液；所述缓冲液的pH为4.6。
[0013]优选地，步骤(5)中，沉淀剂中，NaCl的浓度为50
‑
90mg/mL。
[0014]优选地，步骤(5)中，所述结晶的温度为2
‑
6℃，结晶的时间为15h以上。
[0015]优选地，步骤(4)中，所述离子液体为1,3
‑
二丁基咪唑氯代盐。
[0016]优选地，所述离子液体水溶液的浓度为0.2mol/L。
[0017]有益效果：
[0018](1)与传统的结晶方法相比，采用离子液体为添加剂可使蛋清在较低的浓度下不受复杂基质的影响，实现从蛋清中结晶溶菌酶，得到的晶体尺寸大、晶型好、纯度高且生物活性强。
[0019](2)实验操作步骤简单、环境条件容易控制，结晶用时较短，在冰箱4℃条件下约15h即可。
[0020](3)实现了在鸡蛋清中不用引入外来蛋白或者晶种就能够直接结晶，是鸡蛋中提纯溶菌酶的又一简单快速的方法。
[0021](4)采用本专利技术的方法提取得到的溶菌酶的尺寸在150
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400μm之间，晶型为四方晶型，且纯度高，与溶菌酶标准品的比活值基本相当。
附图说明
[0022]构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。其中：
[0023]图1为本专利技术实施例得到的蛋清粉的实物图；
[0024]图2为本专利技术实施例1和对比例1在不同条件下的结晶过程图(图中“IL free”是指结晶过程中不添加离子液体)；
[0025]图3为蛋清粉结晶的溶菌酶SDS
‑
PAGE凝胶电泳图，其中泳道1为蛋白Marker(kDa)；2为蛋清的100倍稀释液；3为卵清蛋白标准品(0.5mg/mL)；4为溶菌酶标准品(0.5mg/mL)；5为实施例1提取到的溶菌酶晶体溶液；
[0026]图4溶菌酶比活测试结果图；其中，1为鸡蛋白溶菌酶标准品；2为实施例1提取得到的溶菌酶晶体；
[0027]图5为本专利技术实施例1从鸡蛋中结晶溶菌酶的工艺流程图。
具体实施方式
[0028]下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普
通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0029]下面将结合实施例来详细说明本专利技术。需要说明的是，在不冲突的情况下，本专利技术中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
[0030]本专利技术针对目前现有技术从鸡蛋中提取溶菌酶时存在的需要引入溶菌酶晶种，提取得到的溶菌酶的晶体尺寸小、时间长中的至少一项问题，提供一种利用离子液体提取鸡蛋中溶菌酶的方法。本专利技术实施例的利用离子液体提取鸡蛋中溶菌酶的方法包括下述步骤：(1)对蛋清进行过滤，并将所得滤液与水均匀混合，得到蛋清溶液；(2)调节蛋清溶液的pH至4.5，水浴加热；(3)对经步骤(2)处理所得反应液进行离心，收集所得上清液，冷冻干燥，得到蛋清粉；(4)将蛋清粉溶于离子液体水溶液中，离心，除去不溶物(收集所得液体)；(5)采用悬滴法，使步骤(4)除本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用离子液体提取鸡蛋中溶菌酶的方法，其特征在于，包括下述步骤：(1)对蛋清进行过滤，并将所得滤液与水均匀混合，得到蛋清溶液；(2)调节所述蛋清溶液的pH至4.5，水浴加热；(3)对经步骤(2)处理所得反应液进行离心，收集所得上清液，冷冻干燥，得到蛋清粉；(4)将所述蛋清粉溶于离子液体水溶液中，离心，除去不溶物；(5)采用悬滴法，使步骤(4)除去不溶物后所得液体在沉淀剂和缓冲液存在的条件下结晶，所得晶体即为溶菌酶。2.根据权利要求1所述的利用离子液体提取鸡蛋中溶菌酶的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述水浴加热的温度为95
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100℃，时间为80
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120s。3.根据权利要求1所述的利用离子液体提取鸡蛋中溶菌酶的方法，其特征在于，步骤(3)中，离心的速度为8000
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12000rpm，离心时间为4
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6min。4.根据权利要求1所述的利用离子液体提取鸡蛋中溶菌酶的方法，其特征在于，步骤(3)中，冷冻干燥的时间为24h以上。5.根据权利要求1所述的利用离子液体提取鸡蛋中溶菌酶的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：姬燕培，田莹莹，席文昌，朱莹，
申请(专利权)人：河南工学院，
类型：发明
国别省市：