一种检测碱性磷酸酶活性的荧光方法技术

本发明专利技术涉及一种检测碱性磷酸酶活性的荧光方法，将对氨基苯磷酸作为底物，在水溶液中，该底物分子经碱性磷酸酶的催化水解生成对氨基苯酚，对氨基苯酚可以与后续加入的乙二胺发生反应，生成强荧光发射的聚合物碳点。体系中的碱性磷酸酶活性越高，生成的荧光聚合物碳点就越多，荧光就越强，根据检测溶液的荧光强度变化，进行碱性磷酸酶活性的定量检测。本发明专利技术的方法能够对碱性磷酸酶活性进行荧光定量检测，检出限为0.1mU/mL，具有灵敏度高，抗干扰能力强，线性关系优异等优点。本发明专利技术所用试剂简单易得，操作简便，重复性好，为临床样品中碱性磷酸酶活性的定量检测提供了一种灵敏有效且准确度高的荧光方法。

A fluorescence method for detecting alkaline phosphatase activity

The invention relates to a fluorescent method for detecting the activity of alkaline phosphatase, in which p-aminophenylphosphate is used as a substrate, in an aqueous solution, the substrate molecule is hydrolyzed to p-aminophenol by the catalysis of alkaline phosphatase, and p-aminophenol can react with the subsequent addition of ethylenediamine to generate a polymer carbon point with strong fluorescence emission. The higher the alkaline phosphatase activity in the system, the more carbon spots and fluorescence intensity of the fluorescent polymer will be generated. According to the change of fluorescence intensity of the detection solution, the quantitative detection of alkaline phosphatase activity will be carried out. The method has the advantages of high sensitivity, strong anti-interference ability, excellent linear relationship and the like, which can carry out fluorescence quantitative detection for alkaline phosphatase activity, and the detection limit is 0.1mu/ml. The reagent used by the invention is simple and easy to obtain, easy to operate and has good repeatability, and provides a sensitive, effective and high accuracy fluorescence method for quantitative detection of alkaline phosphatase activity in clinical samples.

【技术实现步骤摘要】
一种检测碱性磷酸酶活性的荧光方法
本专利技术属于化学分析检测
，具体涉及一种检测碱性磷酸酶活性的荧光方法。
技术介绍
碱性磷酸酶(ALP)是一种广泛存在于人体、动物、植物及微生物体内的膜结合糖蛋白，它直接参与催化磷酸基团的转移和代谢等生理过程，在细胞生长凋亡进程中的信号传导和细胞内调节过程中扮演重要角色，对体内钙磷的吸收与代谢、维持体内适宜的钙磷比例和动物的骨化过程中有极其重要的作用。人体的肝脏、骨骼、肠、肾和胎盘等组织中普遍存在着碱性磷酸酶，同时，血浆中碱性磷酸酶的异常表达与多种疾病有关，如骨骼疾病，糖尿病，乳腺癌，前列腺癌及肝功能异常等。另一方面，由于碱性磷酸酶的分子量较低、活性较稳定、易于提纯，因此从各种动物、植物、微生物中提取的商品化碱性磷酸酶，被广泛应用于酶联免疫分析、生物传感器、分子生物学等研究领域。因此，发展更简便灵敏、更优选择性的碱性磷酸酶活性检测方法不仅可以利于骨骼、肝胆系统等疾病的诊断和鉴别诊断，还可以结合抗体构建新颖的酶联免疫分析体系检测特定的疾病靶标。截至目前，通过色谱法，比色法，化学发光法，电化学法，荧光法，表面增强共振拉曼散射等不同的分析技术已经发展了多种碱性磷酸酶活性的检测方法。其中，荧光检测技术由于其简单灵敏、实时性和在体检测等优点而受到了高度关注。尤其值得注意的是，基于荧光物质生成反应构建的荧光“点亮”型生物分析技术，通常操作更加简便，背景干扰更低，检测灵敏度更高，因此具有更好的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种检测碱性磷酸酶活性的荧光方法，该检测方法所用试剂简单易得，操作简便，重复性好，灵敏度高。为了实现上述目的，本专利技术的技术方案具体如下：本专利技术提供一种检测碱性磷酸酶活性的荧光方法，包括以下步骤：步骤一：将对氨基苯磷酸(APP)水溶液分别与不同已知活性的碱性磷酸酶标准溶液在缓冲溶液中混合孵育；步骤二：在步骤一制备的混合溶液中分别加入乙二胺水溶液，进一步混合孵育，进行荧光光谱测试；步骤三：利用碱性磷酸酶标准溶液活性和荧光光谱强度的线性关系，绘制标准曲线；步骤四：将对氨基苯磷酸(APP)水溶液与待测碱性磷酸酶溶液在缓冲溶液中混合孵育；步骤五：在步骤四制备的混合溶液中加入乙二胺水溶液，进一步混合孵育，进行荧光光谱测试，得到待测碱性磷酸酶溶液的荧光光谱强度；步骤六：利用步骤三的标准曲线及步骤五测得的荧光光谱强度，计算得到待测碱性磷酸酶活性。在上述技术方案中，优选碱性磷酸酶标准溶液的活性为：0～70mU/mL。在上述技术方案中，优选步骤一和四中对氨基苯磷酸水溶液的浓度为0.25～6.25mM。在上述技术方案中，优选步骤一和四中缓冲溶液是pH＝8.0～11.0的10～100mMTris-HCl溶液，并含有MgCl2浓度为0.1～5mM。在上述技术方案中，进一步优选缓冲溶液是pH＝10.0，对氨基苯磷酸水溶液的浓度为2.5mM。在上述技术方案中，优选步骤一和四中孵育温度为20～37℃，时间为10～90min。在上述技术方案中，进一步优选步骤一和四中孵育温度为37℃，时间为60min。在上述技术方案中，优选步骤二和五中乙二胺水溶液的浓度为100～1000mM。在上述技术方案中，优选步骤二和五中孵育温度为20～37℃，时间为20～180min。在上述技术方案中，进一步优选步骤二和五中孵育温度为37℃，时间为120min。本专利技术的有益效果是：本专利技术提供的检测碱性磷酸酶活性的荧光方法，将对氨基苯磷酸作为底物，在水溶液中，该底物分子经碱性磷酸酶的催化水解生成对氨基苯酚，对氨基苯酚可以与后续加入的乙二胺发生反应，生成强荧光发射的聚合物碳点。体系中的碱性磷酸酶活性越高，生成的荧光聚合物碳点就越多，荧光就越强，根据检测溶液的荧光强度变化，进行碱性磷酸酶活性的定量检测。本专利技术的方法能够对碱性磷酸酶活性进行荧光定量检测，检出限为0.1mU/mL，具有灵敏度高，抗干扰能力强，线性关系优异等优点。本专利技术的方法能够在稀释人血清样品中进行检测，因此可用于临床样品中碱性磷酸酶活性的灵敏准确检测。本专利技术所用试剂简单易得，操作简便，重复性好，为临床样品中碱性磷酸酶活性的定量检测提供了一种灵敏有效且准确度高的荧光方法。本专利技术所需仪器设备普及程度较高，所需试剂均为商业化产品，过程简单、重复性好，对操作人员无特殊技术要求。附图说明下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细说明。图1为本专利技术的碱性磷酸酶活性荧光检测方法示意图。图2为本专利技术利用荧光光谱检测碱性磷酸酶可行性分析图(其中a为对氨基苯磷酸，b为对氨基苯磷酸+乙二胺，c为碱性磷酸酶+乙二胺，d为对氨基苯磷酸+碱性磷酸酶，e为对氨基苯磷酸+碱性磷酸酶+乙二胺，f为对氨基苯酚+乙二胺，均为溶液孵育后测试)。图3为对氨基苯酚与乙二胺合成荧光聚合物碳点光谱图(左)和透射电镜图(右)(其中a,b,c分别为乙二胺、对氨基苯酚和碳点吸收光谱；d,e分别为碳点的荧光激发和发射光谱)。图4为本专利技术中缓冲溶液pH值的优化测试图；控制pH分别为8,9,10,11。图5为本专利技术中加入底物对氨基苯磷酸浓度的优化测试图；控制对氨基苯磷酸终浓度分别为0，0.1mM，0.25mM，0.5mM，1.0mM，1.5mM，2.0mM，2.5mM。图6为本专利技术中对氨基苯磷酸与碱性磷酸酶溶液在缓冲溶液中混合酶解孵育时间的优化测试图；控制酶解孵育时间分别为10min，20min，30min，40min，50min，60min，70min，80min，90min。图7为本专利技术中对氨基苯磷酸与碱性磷酸酶溶液在缓冲溶液中孵育后的混合溶液，再加入乙二胺混合荧光反应孵育时间的优化测试图；控制荧光反应孵育时间分别为20min，40min，60min，80min，120min，180min。图8为本专利技术中溶液荧光光谱随碱性磷酸酶活性的变化曲线(A)及标准工作曲线(B,C)；控制碱性磷酸酶活性为0mU/mL，0.1mU/mL，0.5mU/mL，1mU/mL，2mU/mL，3mU/mL，4mU/mL，5mU/mL，6mU/mL，7mU/mL，8mU/mL，9mU/mL，10mU/mL，15mU/mL，20mU/mL，30mU/mL，40mU/mL，50mU/mL，60mU/mL，80mU/mL。图9为本专利技术用于检测碱性磷酸酶活性的特异性测试图；选择的潜在干扰酶或蛋白质包括牛血清白蛋白BSA，核酸内切酶EcoRI，葡萄糖氧化酶GOx，人血清白蛋白HSA，溶菌酶Lysozyme，胰蛋白酶Trypsin。具体实施方式下面将结合实施例与附图对本专利技术作进一步阐述，以下实施例仅为本专利技术的优选实施例，以便于更好地理解本专利技术，因而不应视为限定本专利技术的范围。所述方法均为常规方法，所述原料均能从公开商业途径获得。实施例1<本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测碱性磷酸酶活性的荧光方法，其特征在于，包括以下步骤：/n步骤一：将对氨基苯磷酸水溶液分别与不同已知活性的碱性磷酸酶标准溶液在缓冲溶液中混合孵育；/n步骤二：在步骤一制备的混合溶液中分别加入乙二胺水溶液，进一步混合孵育，进行荧光光谱测试；/n步骤三：利用碱性磷酸酶标准溶液活性和荧光光谱强度的线性关系，绘制标准曲线；/n步骤四：将对氨基苯磷酸水溶液与待测碱性磷酸酶溶液在缓冲溶液中混合孵育；/n步骤五：在步骤四制备的混合溶液中加入乙二胺水溶液，进一步混合孵育，进行荧光光谱测试，得到待测碱性磷酸酶溶液的荧光光谱强度；/n步骤六：利用步骤三的标准曲线及步骤五测得的荧光光谱强度，计算得到待测碱性磷酸酶活性。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测碱性磷酸酶活性的荧光方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：将对氨基苯磷酸水溶液分别与不同已知活性的碱性磷酸酶标准溶液在缓冲溶液中混合孵育；
步骤二：在步骤一制备的混合溶液中分别加入乙二胺水溶液，进一步混合孵育，进行荧光光谱测试；
步骤三：利用碱性磷酸酶标准溶液活性和荧光光谱强度的线性关系，绘制标准曲线；
步骤四：将对氨基苯磷酸水溶液与待测碱性磷酸酶溶液在缓冲溶液中混合孵育；
步骤五：在步骤四制备的混合溶液中加入乙二胺水溶液，进一步混合孵育，进行荧光光谱测试，得到待测碱性磷酸酶溶液的荧光光谱强度；
步骤六：利用步骤三的标准曲线及步骤五测得的荧光光谱强度，计算得到待测碱性磷酸酶活性。


2.根据权利要求1所述的检测碱性磷酸酶活性的荧光方法，其特征在于，碱性磷酸酶标准溶液的活性为：0～70mU/mL。


3.根据权利要求1所述的检测碱性磷酸酶活性的荧光方法，其特征在于，步骤一和四中对氨基苯磷酸水溶液的浓度为0.25～6.25mM。


4.根据权利要求1所述的检测碱性磷酸酶活性的荧光方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙健，杨秀荣，刘国永，邢志财，
申请(专利权)人：中国科学院长春应用化学研究所，
类型：发明
国别省市：吉林;22