一种化学发光法定量检测阴道毛滴虫的试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术提供一种化学发光法定量检测阴道毛滴虫的试剂盒，在使用时，样本中的阴道毛滴虫抗原与试剂盒中的试剂反应生成中性亲和素微球‑捕获抗体‑抗原‑检测抗体‑吖啶酯复合物，洗涤除去未参加反应的物质，通过吖啶酯在碱性H

A chemiluminescence kit for quantitative detection of Trichomonas vaginalis and its detection method

The invention provides a kit for quantitative detection of Trichomonas vaginalis by chemiluminescence method. When in use, the antigen of Trichomonas vaginalis in the sample reacts with the reagent in the kit to generate a neutral avidin microsphere \u2011 capture antibody \u2011 antigen \u2011 detection antibody \u2011 acridine ester complex, wash and remove the substances not involved in the reaction, and wash and remove the substances not involved in the reaction through acridine ester in basic H

【技术实现步骤摘要】
一种化学发光法定量检测阴道毛滴虫的试剂盒及其检测方法
本专利技术属于体外诊断
，具体涉及一种化学发光法定量检测阴道毛滴虫的试剂盒及其检测方法。
技术介绍
阴道毛滴虫(Trichomonias)是寄生在人体泌尿生殖道的有鞭毛的原虫生物，可引起阴道炎和尿道炎，是HIV感染和诱发宫颈癌的危险因素之一。女性妊娠中期感染阴道毛滴虫易发生早产、低重儿等。有文献认为滴虫感染是男性非淋球菌性尿道炎的重要病因之一。全世界每年阴道毛滴虫感染的发病人数为1.8亿，滴虫病被认为是最流行的性传播疾病。目前，滴虫检查方法主要有病原学诊断、免疫学方法、分子生物学等。病原学诊断包括湿片法、涂片染色法及培养法。湿片法即取阴道后穹隆分泌物、尿道分泌物、尿液沉淀物或前列腺液，用生理盐水直接涂片，湿片检查。该法检测结果易受样本处置方式及检测人员的技术熟练程度相关。涂片染色法敏感性不够高，且受大小与滴虫类似的颗粒干扰。培养法被认为是诊断滴虫的“金标准”，其敏感性高，但其培养耗时较长，临床应用较少。分子生物学方法，主要采用核酸分子杂交技术或PCR技术，其敏感性和特异性均较高，但是其对实验条件要求较高，可能会有污染的问题，且成本较高。常用的免疫学方法有ELISA法、直接荧光抗体法，乳胶凝集法、免疫层析试验，其敏感度较湿片法高。目前市场上一般为定性产品。
技术实现思路
为了解决以上的技术问题，本专利技术提供一种阴道毛滴虫定量分析的试剂盒及其检测方法，所述检测方法灵敏度高、线性范围广，所述试剂盒设备简单、操作方便、分析快、便于实现自动化。本专利技术的目的在于提供一种化学发光法定量检测阴道毛滴虫的试剂盒。本专利技术的另一目的在于提供一种利用上述的试剂盒定量检测阴道毛滴虫的方法。根据本专利技术的目的，本专利技术提供一种化学发光法定量检测阴道毛滴虫的试剂盒，包括中性亲和素偶联磁微球、生物素化抗体、吖啶酯标记的抗体、样本稀释液、校准品、洗涤液和化学发光底物。本专利技术提供的试剂盒用于定量检测阴道毛滴虫，当样本中含有阴道毛滴虫抗原时，中性亲和素偶联微球、生物素化抗体与抗原在37℃中进行反应，加入吖啶酯标记的检测抗体，形成中性亲和素微球-捕获抗体-抗原-检测抗体-吖啶酯复合物，用洗涤液除去未参加反应的物质，通过吖啶酯在化学发光底物中，分子受到化学发光底物中的氧化氢离子的进攻时，生成不稳定的二氧乙烷，此二氧乙烷分解为CO2和电子激发态的N-甲基吖啶酮，当其回到基态时发出光子，利用发光信号测量仪器测量光量子产额进行定量测定，同时通过校准品，拟合定量标准曲线，通过将样本的光信号测定结果带入到定量标准曲线中，从而计算出阴道毛滴虫的浓度。优选地，所述中性亲和素偶联磁微球通过以下方法制备得到：取表面活性基团含有羧基的磁微球，然后在化学交联剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺作用下与含有氨基基团的中性亲和素形成中性亲和素偶联磁微球。本专利技术提供的中性亲和素偶联磁微球为中性亲和素与磁微球偶联得到，采用含有表面活性基团羧基的磁微球在化学交联剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)作用下，与中性亲和素的氨基基团形成酰胺键而共价结合，形成稳定的中性亲和素偶联磁微球。优选地，所述生物素化抗体为生物素N-羟基丁二酰亚胺酯(BNHS)与阴道毛滴虫单克隆抗体偶联得到。优选地，所述吖啶酯标记的抗体为吖啶酯与阴道毛滴虫单克隆抗体偶联得到。优选地，所述样本稀释液包括：二水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、吐温20、氯化钠和氯化钾，所述样本稀释液的浓度为：0.01-0.02mol/L，所述样本稀释液中吐温20的含量为0.01-0.05wt％。本专利技术提供给的样本稀释液中含有非离子表面活性剂吐温20，它使样本中阴道毛滴虫在反应体系中得到良好的分散，有利于阴道毛滴虫与抗体的结合，减少非特异性结合，提高抗体特异性识别的的能力。优选地，所述校准品通过以下方法制备得到：将已计数的阴道毛滴虫悬液用样本稀释液稀释为若干个校准品。优选地，所述洗涤液包括：二水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、吐温20、氯化钠和氯化钾；所述洗涤液的浓度为：0.01-0.02mol/L，所述洗涤液中吐温20的含量为0.05-1wt％。优选地，所述化学发光底物包括A液和B液；A液包括双氧水和硝酸溶液，B液包括氢氧化钠和吐温100。进一步优选地，所述双氧水的浓度为0.1-0.5％，所述硝酸溶液的浓度为0.01-1％，所述氢氧化钠的浓度为0.5-1％，所述吐温100的浓度为0.1-0％。本专利技术提供的化学发光底物以氢氧化钠与双氧水为基础，硝酸和表面活性剂吐温100为增强剂。本专利技术提供的上述试剂盒的制备方法，包括以下步骤：(1)制备中性亲和素偶联磁微球：用活化缓冲液洗涤磁微球，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液活化磁微球，混匀后，于旋转混合仪上37℃反应，磁吸附去上清，然后使用pH为7.5-8.5的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)洗涤，获得活化后的磁微球，加入中性亲和素，旋转混合仪上反应2-3h，采用所述洗涤液(PBST)洗涤三次，所述洗涤液(PBST)包括：二水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、吐温20、氯化钠和氯化钾；其中所述吐温20的用量为0.05-1％；加入甘氨酸和乙醇胺溶液封闭过夜；去上清，加入磁微球保存液保存于2-8℃备用；(2)制备生物素化抗体：将阴道毛滴虫抗体透析后，加入生物素，常温反应2-4h，用氯化铵溶液封闭，PBS缓冲液中透析过夜，收集反应物，得到生物素化抗体；(3)制备吖啶酯标记的抗体：将阴道毛滴虫抗体以碳酸缓冲液充分透析后，加入吖啶酯，常温反应2h，用赖氨酸溶液封闭，PBS缓冲液中透析过夜，收集反应物，得到吖啶酯标记的抗体；(4)制备阴道毛滴虫校准品：将已计数的阴道毛滴虫悬液用样本稀释液稀释为若干校准品；(5)制备样本稀释液：所述样本稀释液包括吐温20；(6)制备化学发光底物：所述化学发光底物包括A液和B液；A液包括0.1-0.5％的双氧水和0.01-1％的硝酸溶液，B液包括0.5-1mol/L氢氧化钠溶液和0.1-1％的吐温100。本专利技术提供一种化学发光法定量检测阴道毛滴虫的方法，采用上述的化学发光法定量检测阴道毛滴虫的试剂盒进行检测，所述方法包括以下步骤：(1)依次加入中性亲和素偶联磁微球、生物素化抗体及待测样本在35-37℃中反应15-18min；然后加入吖啶酯标记的抗体在35-37℃反应15-18min，洗涤除去未参加反应的物质，加入化学发光底物，通过化学发光检测仪检测，得到待测样本的发光信号；(2)利用样本稀释液、校准品制备阴道毛滴虫标准品，建立定量标准曲线；(3)将步骤(1)中得到的所述待测样本的发光信号代入到步骤(2)中得到的定量标准曲线中，计算得到待测样本中阴道毛滴虫的浓度。本专利技术通过建立系列标准菌液浓度与本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种化学发光法定量检测阴道毛滴虫的试剂盒，其特征在于，包括中性亲和素偶联磁微球、生物素化抗体、吖啶酯标记的抗体、样本稀释液、校准品、洗涤液和化学发光底物。/n

【技术特征摘要】
1.一种化学发光法定量检测阴道毛滴虫的试剂盒，其特征在于，包括中性亲和素偶联磁微球、生物素化抗体、吖啶酯标记的抗体、样本稀释液、校准品、洗涤液和化学发光底物。


2.根据权利要求1所述的化学发光法定量检测阴道毛滴虫的试剂盒，其特征在于，所述中性亲和素偶联磁微球通过以下方法制备得到：取表面活性基团含有羧基的磁微球，然后在化学交联剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺作用下与含有氨基基团的中性亲和素形成中性亲和素偶联磁微球。


3.根据权利要求1所述的化学发光法定量检测阴道毛滴虫的试剂盒，其特征在于，所述生物素化抗体为生物素N-羟基丁二酰亚胺酯与阴道毛滴虫单克隆抗体偶联得到。


4.根据权利要求1所述的化学发光法定量检测阴道毛滴虫的试剂盒，其特征在于，所述吖啶酯标记的抗体为吖啶酯与阴道毛滴虫单克隆抗体偶联得到。


5.根据权利要求1所述的化学发光法定量检测阴道毛滴虫的试剂盒，其特征在于，所述样本稀释液包括：二水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、吐温20、氯化钠和氯化钾，所述样本稀释液的浓度为：0.01-0.02mol/L，所述样本稀释液中吐温20的含量为0.01-0.05wt％。


6.根据权利要求5所述的化学发光法定量检测阴道毛滴虫的试剂盒，其特征在于，所述校准品通过以下方法制备得到：将已计数的阴道毛滴虫悬液用所述样本稀释液稀释为若干个校准品。


7.根据权利要求1所述的化学发光法定量检测阴道毛滴虫的试剂盒，其特征在于，所述洗涤液包括：二水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、吐温20、氯化钠和氯化钾；所述洗涤液的浓度为：0.01-0.02mol/L，所述洗涤液中吐温20的含量为0.05-1wt％。


8.根据权利要求1所述的化学发光法定量检测阴道毛滴虫的试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物包括A液和B液；A液包括双氧水和硝酸溶液，B液包括氢氧化钠和吐温100。


9.一种化学发光法定量检测阴道毛滴虫的...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓玲玲，
申请(专利权)人：江苏美克医学技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32