高热稳定性的植酸酶突变体KsPHY9及其基因和应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体涉及高热稳定性的植酸酶突变体KsPHY9及其基因和应用。所述植酸酶突变体KsPHY9的氨基酸序列为氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的植酸酶KsPHY包含以下突变位点：A73P，A80P，D107K，N203D，G211S，Q224E，Q252V，T326Y，K379P。与亲本植酸酶KsPHY的23.7％残留酶活相比，所述植酸酶突变体KsPHY9的残余酶活为56.9％，耐热性大大提高。

High heat stable phytase mutant ksphy9 and its gene and Application

The invention relates to the field of biotechnology, in particular to the high heat stability phytase mutant ksphy9 and its gene and application. The amino acid sequence of the phytase mutant ksphy9 is amino acid sequence. The phytase ksphy shown in SEQ ID No: 1 contains the following mutation sites: a73p, a80p, d107k, n203d, g21s, q224e, q252v, t326y, k379p. Compared with the 23.7% residual enzyme activity of the parental phytase ksphy, the residual enzyme activity of the phytase mutant ksphy9 is 56.9%, and the heat resistance is greatly improved.

【技术实现步骤摘要】
高热稳定性的植酸酶突变体KsPHY9及其基因和应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及高热稳定性的植酸酶突变体KsPHY9及其基因和应用。
技术介绍
植酸(Phytate，Phyticacid，IP6)又称肌醇六磷酸脂，含有6个磷酸基团，带有丰富的磷，是饲料中磷的重要贮存形式。植酸是豆类及谷类等作物种子中磷的主要储存形式，但是单胃动物(如家禽、猪等)由于体内缺乏分解植酸的酶，所以难以有效利用植酸磷，大部分以植酸形式存在的磷被动物直接排出体外，造成严重的环境污染。另外，植酸磷还是一种抗营养因子，它可以和多种金属离子(如Ca2+、Mn2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Fe2+等)以及许多蛋白质螯合成相应的不溶性络合物，降低了这些营养物质的生物有效利用率以及动物对营养物质的有效利用率。植酸酶(phytase),即肌醇六磷酸水解酶(myo-inositolhexakisphosphatephosphohydrolase,EC3.1.3.8)，是催化植酸(肌醇六磷酸)及其植酸盐水解生成肌醇与磷酸(或磷酸盐)的一类酶的总称，属于组氨酸磷酸酶家族。在饲料中添加植酸酶，不仅可以提高动物对饲料中植酸磷的利用率，减少磷对环境的污染，还可以降低植酸磷的抗营养作用。植酸酶在动物饲料、人类健康和资源环境保护等方面显现出巨大的应用前景和研究价值。目前市场上商品化的植酸酶制剂大多数都是经过基因优化改良的。植酸酶在饲料制粒工艺中通常需在较高温度下进行，热稳定性差的植酸酶易失活变性，因此筛选出具有高热稳定性的植酸酶在科学研究与工业应用中具有重要的意义。可以采用分子生物学技术对现有产业化的酶蛋白进行改造，获得能够适应不同产业需求的酶。理性设计是通过研究酶蛋白的三维空间结构与作用机理，找出可能影响酶活性或酶特性的关键氨基酸，并对这些氨基酸进行定点突变，从而得到更优的酶蛋白。与非理性设计相比，理性设计效率更高，往往也更能得到好的结果。但是相比随机基因突变，理性设计只是提高实验的成功率，序列分析软件不能保证突变的可靠性。理论预测只是提供了一些可能性，这些预测并不能保证绝对准确，尤其是突变的情况比较复杂的时候，对于其性质和功能的研究还需要详细实验验证。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供高热稳定性的植酸酶KsPHY9。所述高热稳定性植酸酶KsPHY9，是对亲本植酸酶KsPHY进行定点突变，获得的植酸酶突变体。本专利技术的目的是提供一种具有高耐热性的植酸酶突变体KsPHY9的编码基因。本专利技术的再一目的是提供包含上述的耐热提高的植酸酶突变体KsPHY9基因的重组载体。本专利技术的再一目的是提供包含上述耐热提高的植酸酶突变体KsPHY9基因的重组菌株。本专利技术的再一目的是提供获得一种表达高耐热的植酸酶突变体KsPHY9的方法。本专利技术采用定点饱和突变的方法对SEQIDNO.1所示的植酸酶KsPHY进行分子改造，经过高通量筛选得到耐热提高的植酸酶突变体KsPHY9，本专利技术的耐热提高的植酸酶突变体KsPHY9和原有的Kosakoniasacchari植酸酶KsPHY相比，有9个氨基酸的差异，突变的氨基酸位点包括A73P、A80P、D107K、N203D、G211S、Q224E、Q252V、T326Y、K379P，突变后的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术还提供了包含上述耐热提高的植酸酶突变体KsPHY9的重组载体，将本专利技术的耐热提高的植酸酶突变体KsPHY9连接到酵母表达载体pPICzαA上的EcoRI和NotI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPICzαA-KsPHY9。本专利技术还提供了包含上述耐热提高的植酸酶突变体KsPHY9的重组菌株。根据本专利技术的具体实施方式，用于表达所述植酸酶突变体的表达载体为pPICZαA；用于所述表达载体转化的宿主细胞是毕赤酵母X33和GS115。本专利技术还提供了表达上述耐热提高的植酸酶突变体KsPHY9的方法，包括以下步骤：1)用上述重组载体转化宿主细胞，获得重组菌株；2)对重组菌株进行发酵，诱导重组植酸酶的表达；3)发酵结束后，回收并纯化所表达的植酸酶突变体KsPHY9。本专利技术通过定点饱和突变对Kosakoniasacchari植酸酶KsPHY进行分子改造，结合高通量筛选技术筛选出耐热性提高的植酸酶突变体KsPHY9。与亲本植酸酶KsPHY的23.7％残留酶活相比，所述植酸酶突变体KsPHY9的残余酶活为56.9％，耐热性大大提高。附图说明图1为含pPICzαA-KsPHY9的毕赤酵母X33重组菌7L罐发酵图。图2显示KsPHY9酶液与亲本KsPHY酶液80水浴酶活保留率。图3显示原始植酸酶及突变植酸酶的最适反应pH。图4显示原始植酸酶及突变植酸酶的酸碱耐受性比较具体实施方式以下将详述本专利技术改造植酸酶的方法及所获得的热稳定性提高的植酸酶。以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。实验材料和试剂：1、菌株与载体大肠杆菌Topl0、OrigamiB、毕赤酵母X33、载体pPICZαA、Zeocin购自Invitrogen公司。2、酶与试剂超保真2×MasterMixPCR聚合酶、限制性内切酶购自NEB(北京)有限公司；universaiDNAPurificationKit、TIANprepMiniPlasmidKit购自天根生化(北京)科技有限公司，其它试剂均为国产分析纯。3、培养基大肠杆菌培养基为LB培养基(1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，pH7.0)。LB+Amp培养基为LB培养基加入终浓度为100ug/mL的氨苄青霉素。LB+Zeo培养基为LB培养基加入终浓度为25ug/mL的Zeocin。酵母培养基为YPD培养基(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)。酵母筛选培养基为YPD+Zeo培养基(YPD+Zeo培养基为YPD培养基加入终浓度为100ug/mL的Zeocin)。酵母诱导培养基BMGY培养基(1％酵母提取物、2％蛋白胨、1.34％YNB、0.00004％Biotin、1％甘油(V/V))和BMMY培养基(除以0.5％甲醇代替甘油，其余成份相与BMGY相同)。重组酵母发酵培养基本盐培养基：磷酸氢二铵5％、磷酸二氢钾0.5％、七水硫酸镁1.5％、硫酸钾1.95％、硫酸钙0.1％、氢氧化钾0.1％、消泡剂0.03％。高压后1L加4.35mlPTM1。PTM1(微量盐溶液)：硫酸铜0.6％、碘化钾0.018％、一水硫酸锰0.3％、二水钼酸钠0.02％、硼酸0.002％、六水氯化钴0.05％、氯化锌2％、七水硫酸铁6.5％、浓硫酸0本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.热稳定性提高的植酸酶突变体KsPHY9，其特征在于，所述植酸酶突变体KsPHY9的氨基酸序列为氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的植酸酶KsPHY包含以下突变位点：A73P，A80P，D107K，N203D，G211S，Q224E，Q252V，T326Y，K379P。/n

【技术特征摘要】
1.热稳定性提高的植酸酶突变体KsPHY9，其特征在于，所述植酸酶突变体KsPHY9的氨基酸序列为氨基酸序列如SEQIDNO：1所示的植酸酶KsPHY包含以下突变位点：A73P，A80P，D107K，N203D，G211S，Q224E，Q252V，T326Y，K379P。


2.热稳定性提高的植酸酶突变体基因，其特征在于，所述基因编码权利要求1所述的热稳定性提高的植酸酶突变体KsPHY9。


3.包含权利要求2所述的热稳定性提高的植酸酶突变体基因的重组载体。
用于表达所述植酸酶突变体的表达载体是pPICZαA和pPIC9K；用于所述表达载体的宿主细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：李阳源，黄江，何小梅，江民华，陈丽芝，高芝，刘金山，唐业，王勇，王平，
申请(专利权)人：广东溢多利生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44