比活提高的植酸酶APPA突变体及其基因和应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体涉及比活提高的植酸酶APPA突变体及其基因和应用。本发明专利技术采用定点饱和突变的方法对氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的大肠杆菌植酸酶APPA的第53位、第68位、第77位、第96位、第112位、第202位、第233位、第247位和第362位进行分子改造，结合高通量筛选方法获得一系列比活提高的植酸酶突变体，突变体的比活均优于原始酶。

APA mutant with higher specific activity and its gene and Application

The invention relates to the field of biotechnology, in particular to a phytase AppA mutant with improved specific activity and its gene and application. The invention adopts the method of site-specific saturation mutation to modify the 53rd, 68th, 77th, 96th, 112th, 202nd, 233rd, 247th and 362nd positions of E.

【技术实现步骤摘要】
比活提高的植酸酶APPA突变体及其基因和应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及比活提高的植酸酶APPA突变体及其基因和应用。
技术介绍
植酸(Phytate，Phyticacid，IP6)又称肌醇六磷酸脂，含有6个磷酸基团，带有丰富的磷，是饲料中磷的重要贮存形式。植酸酶(Phytase)能够催化植酸及植酸盐水解成肌醇与磷酸(或磷酸盐)。饲料中添加植酸酶，不仅可以提高动物对饲料中植酸磷的利用率，减少磷对环境的污染，还可以降低植酸磷的抗营养作用。植酸酶广泛存在于动物、植物和微生物中，目前市场上商品化的植酸酶均来源于微生物。研究表明来源于大肠杆菌的植酸酶(APPA)是目前分解植酸能力最强的植酸酶。目前市场上商品化的植酸酶制剂大多数都是经过优化改良的，优化改良的植酸酶在热稳定上有了较大的提高，但是比活和生产效率的下降也令人堪忧，因此怎样提高植酸酶比活和生产效率是企业提高产品质量、降低成本的关注焦点。采用分子生物学技术对现有产业化的酶蛋白进行改造，获得能够适应不同产业需求的酶。理性设计是通过研究酶蛋白的三维空间结构与作用机理，找出可能影响酶活性或酶特性的关键氨基酸，并对这些氨基酸进行定点突变，从而得到更优的酶蛋白。与非理性设计相比，理性设计效率更高，往往也更能得到好的结果。但是相比随机基因突变，理性设计只是提高实验的成功率，序列分析软件不能保证突变的可靠性。理论预测只是提供了一些可能性，这些预测并不能保证绝对准确，尤其是突变的情况比较复杂的时候，对于其性质和功能的研究还需要详细实验验证。并且，一个突变区域有N个突变的位点，一个突变位点有18个突变体。几个突变位点的组合又是千变万化，不可能通过软件得出一样的数据。
技术实现思路
本专利技术的目的是通过对来源于大肠杆菌的植酸酶APPA进行分子改造，使改造后的植酸酶具有更高的比活，降低生产成本。本专利技术的目的是提供比活提高的植酸酶APPA突变体。本专利技术的再一目的是提供比活提高的植酸酶APPA突变体基因。本专利技术的再一目的是提供包含上述提供比活提高的植酸酶APPA突变体基因的重组载体。本专利技术的再一目的是提供包含上述提供比活提高的植酸酶APPA突变体基因的重组菌株。本专利技术的再一目的是提供制备上述比活提高的植酸酶APPA突变体的方法。本专利技术的再一目的是提供上述比活提高的植酸酶APPA突变体的应用。本专利技术采用定点饱和突变的方法对氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的大肠杆菌植酸酶APPA的第53位、第68位、第77位、第96位、第112位、第202位、第233位、第247位和第362位进行分子改造，结合高通量筛选方法获得一系列比活提高的植酸酶突变体。这些突变体的核苷酸序列如SEQIDNO.2到SEQIDNO.11所示，氨基酸序列如SEQIDNO.13到SEQIDNO.22所示。本专利技术还提供了包含上述植酸酶突变体基因的重组载体。本专利技术还提供了包含上述植酸酶突变体基因的重组菌株，优选重组菌株是毕赤酵母菌株X33。本专利技术还提供了表达上述植酸酶突变体的方法，包括以下步骤：1)用上述的改良的重组表达载体转化宿主细胞，得重组菌株；2)重组菌株进行发酵，诱导重组植酸酶的表达；3)发酵结束后，回收并纯化所表达的植酸酶。本专利技术通过蛋白理性设计对植酸酶APPA进行分子改造，结合高通量筛选方法筛选出比活提高的植酸酶突变体。与原始植酸酶APPA的比活相比，突变后植酸酶比活的提高幅度为24％-86％。附图说明图1显示了原始植酸酶和突变体的pH酶学性质对比。具体实施方式以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。实验材料和试剂：1、菌株与载体大肠杆菌Topl0、大肠杆菌菌株OrigamiB、毕赤酵母X33、载体pPICZαA、pET-22b(+)，Zeocin购自Invitrogen公司。2、酶与试剂超保真2×MasterMixPCR聚合酶、限制性内切酶购自NEB(北京)有限公司；universaiDNAPurificationKit、TIANprepMiniPlasmidKit购自天根生化(北京)科技有限公司，其它试剂均为国产分析纯。3、培养基大肠杆菌培养基为LB培养基(1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，pH7.0)。LB+Amp培养基为LB培养基加入终浓度为100ug/mL的氨苄青霉素。酵母培养基为YPD(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)。酵母筛选培养基为YPDzeo(YPD+100mg/Lzeocin)。酵母诱导培养基BMGY(I％酵母提取物、2％蛋白胨、1.34％YNB、0.00004％Biotin、1％甘油(V/V))和BMMY(除以0.5％甲醇代替甘油，其余成份相与BMGY相同)。重组酵母发酵培养基本盐培养基：磷酸氢二铵5％、磷酸二氢钾0.5％、七水硫酸镁1.5％、硫酸钾1.95％、硫酸钙0.1％、氢氧化钾0.1％、消泡剂0.03％。高压后每升加4.35毫升PTM1。PTM1(微量盐溶液)：硫酸铜0.6％、碘化钾0.018％、一水硫酸锰0.3％、二水钼酸钠0.02％、硼酸0.002％、六水氯化钴0.05％、氯化锌2％、七水硫酸铁6.5％、浓硫酸0.5％、生物素0.02％。实施例1、植酸酶基因的合成及克隆以大肠杆菌来源的植酸酶APPA的氨基酸序列作为参考(如SEQIDNO.10所示)，人工合成该酶的基因序列(核酸序列如SEQIDNO.1所示)。根据基因序列设计引物，5'端引入NdeI酶切位点，3'端引入EcoRI酶切位点，引物序列如下：5'端引物NdeI-APPA-F1：GGATTACCATATGATGTCAGATATGAAAAGCGGAAACA3'端引物EcoRI-APPA-R1：CGGAATTCTTATTTGTCTTGATGGAGAGCGCAC以合成基因APPA为模板，用上述引物进行PCR扩增，获得大小约为1.3kb的DNA条带，回收目的片段，用NdeI和EcoRI进行双酶切，连接到具有相同酶切位点的线性pET-22b(+)载体上，转化至Top10大肠杆菌，LB+Amp平板培养获得pET-22b-APPA阳性克隆子。实施例2、基因定点饱和突变最终确定对12个氨基酸进行定点饱和突变，分别为：第47位、第53位、第68位、第77位、第96位、第112位、第193位、第202位、第233位、第245位、第247位和第362位。针对性的设计了12对饱和突变引物，目的基因突变位点统一为NNS，NNS左右各取15个碱基构成正向引物；反向引物与正向引物完全互补，其中，N代表A、T、G、C四种碱基，S本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.比活提高的植酸酶APPA突变体，其特征在于，所述突变体为氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的植酸酶APPA发生以下突变而得，/n突变位点为：D53C，W68N，I77P，K96A，D112W，N202H，V233D，Q247R，R362D；/n突变位点为：D53A，W68Q，I77A，K96D，D112H，N202H，V233Y，Q247E，R362D；/n突变位点为：D53C，W68N，I77N，K96A，D112W，N202D，V233H，Q247W，R362A；/n突变位点为：D53C，W68N，I77V，K96P，D112Y，N202D，V233Q，Q247R，R362W；/n突变位点为：D53C，W68Q，I77Q，K96P，D112W，N202D，V233Q，Q247R，R362V；/n突变位点为：D53S，W68N，I77P，K96A，D112H，N202H，V233D，Q247N，R362Y；/n突变位点为：D53A，W68N，I77Q，K96D，D112Y，N202D，V233Y，Q247R，R362A；/n突变位点为：D53S，W68Q，I77V，K96P，D112N，N202H，V233D，Q247E，R362W；/n突变位点为：D53C，W68Q，I77A，K96P，D112N，N202D，V233Q，Q247W，R362D；或者/n突变位点为：D53C，W68N，I77Q，K96A，D112W，N202H，V233H，Q247E，R362W。/n...

【技术特征摘要】
1.比活提高的植酸酶APPA突变体，其特征在于，所述突变体为氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的植酸酶APPA发生以下突变而得，
突变位点为：D53C，W68N，I77P，K96A，D112W，N202H，V233D，Q247R，R362D；
突变位点为：D53A，W68Q，I77A，K96D，D112H，N202H，V233Y，Q247E，R362D；
突变位点为：D53C，W68N，I77N，K96A，D112W，N202D，V233H，Q247W，R362A；
突变位点为：D53C，W68N，I77V，K96P，D112Y，N202D，V233Q，Q247R，R362W；
突变位点为：D53C，W68Q，I77Q，K96P，D112W，N202D，V233Q，Q247R，R362V；
突变位点为：D53S，W68N，I77P，K96A，D112H，N202H，V233D，Q247N，R362Y；
突变位点为：D53A，W68N，I77Q，K96D，D112Y，N202D，V233Y，Q247R，R362A；
突变位点为：D53S，W68Q，I7...

【专利技术属性】
技术研发人员：李阳源，黄江，何小梅，江民华，陈丽芝，高芝，刘金山，唐业，王勇，王平，
申请(专利权)人：广东溢多利生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44