数字PCR检测长牡蛎白细胞介素17-5基因表达量的引物及探针制造技术

本发明专利技术公开一种PCR检测长牡蛎白细胞介素17‑5基因表达量的引物及探针，所述引物及探针核苷酸序列如下：正向引物：5’‑tccctggtccaccatcatg‑3’；反向引物：5’‑ggaacaccactgaggacttgg‑3’；探针：5’‑cgcgtcagctacc‑3’；所述探针添加的荧光基团为6‑羧基荧光素。引物及探针的准确性和特异性高，故可利用数字PCR技术检测长牡蛎白细胞介素17‑5基因表达量的时序变化，以此作为评价养殖长牡蛎健康状况的指标，所建立的评价体系在养殖贝类病害预警预报中具有潜在应用价值。不需要设置对照组，也无需内参基因（Internal control），突破了传统荧光实时定量PCR检测方法的应用局限。

Primers and probes for detection of il-17-5 gene expression in oyster by digital PCR

The invention discloses a primer and probe for detecting the expression amount of IL-17 \u2011 5 gene in oyster by PCR. The sequence of the primer and probe nucleotide is as follows: forward primer: 5 \u2011 tccgtccaccacccatg \u2011 3 '; reverse primer: 5 \u2011 ggaacaccaccactgagacttgg \u2011 3'; probe: 5 \u2011 cgcgtcagctac \u2011 3 '; the fluorescent group added to the probe is 6 \u2011 carboxyl fluorescein. The primers and probes have high accuracy and specificity, so we can use digital PCR technology to detect the time sequence changes of IL-17 \u2011 5 gene expression in oyster, as an index to evaluate the health status of cultured oyster. The evaluation system established has potential application value in early warning and prediction of cultured shellfish diseases. There is no need to set up the control group or internal control, which breaks through the application limitation of the traditional real-time PCR detection method.

【技术实现步骤摘要】
数字PCR检测长牡蛎白细胞介素17-5基因表达量的引物及探针
本专利技术属于分子生物学和生物化学
，尤其涉及一种数字PCR检测长牡蛎白细胞介素17-5基因表达量的引物及探针。
技术介绍
白细胞介素17（Interleukin17,IL17）在机体的防御系统中发挥了重要的作用。IL17可以通过诱导下游细胞因子（诸如趋化因子或IL8）间接作用于中性粒细胞，促进其增殖和迁移；亦可以与其他细胞因子（IL1、IL6和TNF等）协同作用，激活组织中浸润的中性粒细胞清除病原；此外，IL17还能够促进下游多种参与病原清除的效应分子的表达，例如肠道中的IL17可以增强密封蛋白Claudin和紧密连接蛋白Zonaoccludens-1的合成，从而使上皮细胞间的连接更加紧密，促进机体与肠道内容物及病原微生物的隔离。近期研究发现，长牡蛎基因组中共存在10个IL17家族成员，命名为CgIL17-2~CgIL17-10，其中CgIL17-5在机体炎症反应和环境胁迫适应中发挥至关重要的作用。例如当长牡蛎受到灿烂弧菌的二次刺激后，血淋巴细胞中CgIL17-5的表达量较第一次菌刺激后明显降低；在干露条件下，CgIL17-5基因被干扰后，抗菌肽CgDefensin和促调亡因子CgDFFA基因表达量较对照组有一定程度的降低，抑制凋亡因子CgIAP表达量升高，表明干露条件下高表达量的CgIL17-5可促进细胞的调亡，对长牡蛎防御系统起到了重要的调节作用。CgIL17-5亦可结合于长牡蛎血淋巴细胞表面进而激活免疫相关转录因子，并诱导下游效应分子的表达。上述研究表明，CgIL17-5是一类重要的长牡蛎促炎细胞因子，可参与长牡蛎的免疫防御和环境胁迫响应过程，对机体内稳态的维持起到了重要的作用，可作为养殖长牡蛎健康状态的重要指示分子，对养殖贝类病害预警预报系统的构建具有重要意义。荧光实时定量PCR（Quantitativereal-timePCR，简称qPCR）是用于检测基因mRNA表达水平的经典方法。但此方法只能用于检测基因的相对表达水平，需要设置对照组并选取合适的管家基因作为内参，因此qPCR技术的应用具有很大局限性。相对地，数字PCR是一种核酸分子绝对定量技术，能够直接检出DNA分子的个数，是对起始样品的绝对定量，符合野外调查的需要。但是，迄今为止，没有关于数字PCR检测长牡蛎白细胞介素17-5基因表达量的引物及探针的相关报道，以至于并没有基于数字PCR检测长牡蛎长牡蛎白细胞介素17-5基因表达量的时序变化并以此作为评价养殖长牡蛎健康状况的指标。
技术实现思路
本专利技术是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种数字PCR检测长牡蛎白细胞介素17-5基因表达量的引物及探针。本专利技术的技术解决方案是：一种数字PCR检测长牡蛎白细胞介素17-5基因表达量的引物及探针，其特征在于所述引物及探针核苷酸序列如下：正向引物：5’-TCCCTGGTCCACCATCATG-3’；反向引物：5’-GGAACACCACTGAGGACTTGG-3’；探针：5’-CGCGTCAGCTACC-3’；所述探针添加的荧光基团为6-羧基荧光素。本专利技术设计的数字PCR检测长牡蛎白细胞介素17-5基因表达量的引物及探针的准确性和特异性高，故可利用数字PCR技术检测长牡蛎白细胞介素17-5基因表达量的时序变化，以此作为评价养殖长牡蛎健康状况的指标，所建立的评价体系在养殖贝类病害预警预报中具有潜在应用价值。不需要设置对照组，也无需内参基因（Internalcontrol），突破了传统荧光实时定量PCR检测方法的应用局限。附图说明图1为本专利技术实施例中长牡蛎CgIL17-5的qPCR扩增曲线和反应程序图。图2为本专利技术实施例中长牡蛎CgIL17-5的数字PCR反应的质量控制图。图3本专利技术实施例不同时期养殖长牡蛎血淋巴细胞中CgIL17-5基因的绝对表达量图。具体实施方式1.CgIL17-5序列筛查及引物设计从长牡蛎基因组中鉴定得到白细胞介素17-5（CgIL17-5,CGI_10004922）的全长序列，查找其ORF。2.CgIL17-5的数字PCR引物和探针设计利用ThermoFisher公司的PrimerExpressV3.0软件根据CgIL17-5的ORF序列设计数字PCR引物和探针。引物和探针序列信息如下：正向引物：5’-TCCCTGGTCCACCATCATG-3’；反向引物：5’-GGAACACCACTGAGGACTTGG-3’；探针：5’-CGCGTCAGCTACC-3’；数字PCR的正向引物长19bp，Tm值59.0°C；反向引物长21bp，Tm值57.0°C；探针长13bp，Tm值68.0°C，制备方式为采用HPLC制备，探针添加的荧光基团为6-羧基荧光素（6-FAM）。实验例1：长牡蛎血淋巴细胞中CgIL17-5基因绝对表达量的检测1.样品收集用牡蛎刀撬开长牡蛎外壳之后，以10mL注射器刺破血窦并抽取血淋巴；500目筛绢过滤后加入1.5mLEP管中，800g离心10min，收集血淋巴细胞。2.总RNA提取及cDNA文库构建向每个盛有血淋巴细胞的EP管中加入1mLTrizolreagent。向每1mL样品加入200μL预冷的氯仿（-20℃保存），剧烈震荡3min，4℃，12,000g离心15min。小心吸取上层透明液体400μL，加入相同体积的预冷异丙醇（-20℃保存），充分混匀后置于-80℃超低温冰箱中自然沉降。10min后，取出样品，4℃，12,000g离心15min。弃去管中液体，加入1mL75%无菌乙醇；用手指轻弹起管底沉淀，4℃，12,000g离心5min。弃去管中液体，4℃，12,000g离心30s，用1mL注射器小心吸干管底残留液体。开盖静置2~3min，使乙醇充分挥发干净。每管加入20μLDEPC水溶解RNA。取微量样品进行核酸电泳以检测RNA质量。用DNA酶消化混于RNA中的DNA，采用两步法合成cDNA文库第一条链。3.qPCR法验证数字PCR引物和探针的有效性利用本专利技术实施例的数字PCR引物，按照如下反应体系（14.5μL）进行实验：试剂体积QuantStudio™3DDigitalPCRMasterMixv27.3μL探针（终浓度200nM）0.7μL正向引物（终浓度900nM）0.7μL反向引物（终浓度900nM）0.7μLcDNA模板1.4μLDEPC水3.7μLqPCR反应程序：50℃2min；95℃10min，95℃15，50个循环；60℃1min。采用7500分析软件，得到Ct值。利用2-ΔΔ本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种数字PCR检测长牡蛎白细胞介素17-5基因表达量的引物及探针，其特征在于所述引物及探针核苷酸序列如下：/n正向引物：5’- TCCCTGGTCCACCATCATG -3’；/n反向引物：5’- GGAACACCACTGAGGACTTGG-3’；/n探针：5’- CGCGTCAGCTACC-3’；/n所述探针添加的荧光基团为6-羧基荧光素。/n

【技术特征摘要】
1.一种数字PCR检测长牡蛎白细胞介素17-5基因表达量的引物及探针，其特征在于所述引物及探针核苷酸序列如下：
正向引物：5’-TCCCTGGTCCACCATCATG-3’...

【专利技术属性】
技术研发人员：王玲玲，刘兆群，张玉坤，宋林生，宗亚男，
申请(专利权)人：大连海洋大学，
类型：发明
国别省市：辽宁;21