用于癌症免疫疗法的MR1限制性T细胞受体制造技术

本发明专利技术涉及分离可表达T细胞受体的T细胞的方法，该T细胞受体能够特异性结合通过与MR分子相关联的癌细胞呈递的抗原。该方法包括以下步骤：(a)提供T细胞制剂；(b)使制剂与表达MR1蛋白的癌细胞接触；(c)分离与所述癌细胞产生特异反应的T细胞。本发明专利技术进一步涉及一种制备T细胞制剂的方法，该T细胞制剂在转基因表达载体上表达选择性识别MR1的T细胞受体，该T细胞制剂在癌症治疗中的应用，以及编码响应MR1的T细胞受体的核酸和细胞的集合。

MR1 restricted T cell receptor for cancer immunotherapy

The invention relates to a method for isolating T cells capable of expressing T cell receptors, which can specifically bind antigens presented by cancer cells associated with Mr molecules. The method comprises the following steps: (a) providing a T-cell preparation; (b) contacting the preparation with a cancer cell expressing MR1 protein; and (c) separating a T-cell that has a specific reaction with the cancer cell. The invention further relates to a method for preparing a T-cell preparation, which expresses a T-cell receptor for selectively recognizing MR1 on a transgenic expression vector, the application of the T-cell preparation in cancer treatment, and the aggregation of nucleic acids and cells encoding a T-cell receptor responsive to MR1.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于癌症免疫疗法的MR1限制性T细胞受体本专利技术涉及限于非多态性抗原呈递分子MR1的肿瘤反应性人T细胞抗原受体(TCR)的鉴别。从代表新型的人T细胞群(由专利技术人发现并称为MR1T的细胞)的克隆中分离功能性TCR转录序列，该人T细胞群在没有添加任何外来抗原的情况下并以MR1依赖性的方式与表达MR1的肿瘤细胞反应。本专利技术还涉及MR1限制性肿瘤反应性TCR基因序列在癌症治疗中的使用。
技术介绍
T淋巴细胞可以检测多种不同的由非多态性细胞表面分子呈递的非肽抗原，包括脂质和磷酸化类异戊二烯。这些T细胞的多样性表型和功能特性起到保护宿主免受感染、自身免疫和癌症的特殊作用。针对非肽抗原的T细胞库最近增加并包含粘膜相关的恒定T(MAIT)细胞，这些细胞对众多酵母和细菌产生的小核黄素前体作出反应，并由MHCI类相关蛋白MR1呈递。MAIT细胞在人血液、肾脏和肠道中很常见，并且包含大部分驻留在肝脏中的T细胞。活化后，MAIT细胞释放出一系列促炎和免疫调节细胞因子，并可介导直接杀伤被微生物感染的细胞。尚不清楚MR1除了将微生物代谢产物向MAIT细胞呈递之外是否还有其他作用。MR1为非多态性MHCI类蛋白，其在许多细胞类型的表面上以低水平表达。MR1在多个菌种中高度保守，人和小鼠MR1在蛋白质水平上具有>90％的序列同源性。专利技术人提出了存在可识别由MR1呈递的肿瘤相关抗原的人T细胞。这些新型T细胞可能参与肿瘤免疫监视，因此代表了癌症免疫疗法的新工具。用供体或源于患者的T细胞的过继性疗法(其设计成表达选定的肿瘤相关抗原的TCR)代表了在癌症患者中诱导临床相关的抗肿瘤免疫应答的一种有保证且安全的策略。然而，迄今为止已鉴别出的大多数肿瘤相关抗原是由多态性MHC分子呈递的肽。MHC基因的极端多态性限制了该方法在表达独特MHC等位基因的患者中的应用。靶向与非多态性抗原呈递分子(诸如MR1)结合的肿瘤抗原可以克服该限制，并且原则上适用于患有表达MR1的肿瘤的所有患者。使用识别MR1呈递的抗原的肿瘤反应性T细胞受体也可能具有补充由MHC呈递的肽抗原介导的抗肿瘤反应的优点，这排除了肿瘤抗原与相同类型的呈递分子结合所产生的交叉竞争。此外，该策略可提供在相同肿瘤细胞上靶向不同性质的抗原的可能性，从而最大限度地减少在选定性免疫压力下肿瘤逃逸变体的潜在发生。因此，鉴别MR1呈递的肿瘤相关抗原以及识别这些抗原的MR1限制性TCR的表征可能对癌症免疫疗法具有重要意义。基于本领域的上述状态，本专利技术的目的是提供治疗癌症的新型手段和方法。该目的通过独立权利要求的主题实现，并且通过本文公开的从属权利要求、示例和附图提供了进一步有利的解决方案。定义在本说明书的上下文中，术语MR1是指MR1基因(Entrez3140)或MR1基因产物(UniprotQ95460)。在本说明书的上下文中，术语MR1T细胞是指表达能够与癌细胞呈递的MR1分子特异性结合的T细胞受体的T细胞。在本说明书的上下文中，术语MR1T细胞受体是指能够特异性结合由与MR1分子相关的癌细胞呈递的抗原的T细胞受体。在本说明书中，术语阳性当在上下文中用于标记物表达时，是指通过荧光标记的抗体测定的抗原的表达，其中该荧光的中值荧光强度与用同型匹配的抗体染色后得到的荧光强度相比，至少高30％(≥30％)，特别是≥50％或≥80％，所述同型匹配的抗体不与相同的靶细胞特异性结合。这样的标记物表达由该标记物的名称后面的上标“加号”(+)表示，例如CD4+。在本说明书中，当在上下文中用于标记物表达时，术语阴性是指由荧光标记的抗体测定的抗原的表达，其中该荧光的中值荧光强度不高于用同型匹配的抗体染色后得到的荧光强度的130％，特别是不高于115％，所述同型匹配的抗体不与相同的靶细胞特异性结合。这样的标记物表达由标记物名称后面的上标减号(-)表示，例如CD127-。术语抗体是指完整抗体，包括但不限于免疫球蛋白G型(IgG)、A型(IgA)、D型(IgD)、E型(IgE)或M型(IgM)，以及任何与抗原结合的所述抗体的片段或单链和相关或衍生的构建体。该术语涵盖所谓的纳米抗体或单结构域抗体，即由单个单体可变抗体结构域组成的抗体片段。
技术实现思路
在最广泛的意义上，本专利技术涉及治疗癌症的方法，其中从与表达MR1的癌细胞具有反应性的T细胞(MR1T细胞)中分离的TCR序列在患者的T细胞群中基因转移后表达。这些外源性、转基因表达的TCR序列用于将对表达MR1的癌细胞特异性识别能力赋予T细胞，作为对患者肿瘤的治疗。本专利技术类似地涉及T细胞和T细胞制剂，所述T细胞制剂包含用MR1T细胞特异性TCR基因转导的多个T细胞。在某些实施方案中，用MR1T细胞TCR基因转导的T细胞可以与其他治疗干预组合用于过继性细胞免疫疗法。本专利技术还涉及一种促进鉴别从与表达MR1的癌细胞具有反应性的T细胞(MR1T细胞)中分离的TCR序列的研究方法。这涵盖分离识别肿瘤相关抗原的MR1限制性T细胞的方法。用与患者体内相同类型肿瘤的肿瘤细胞系刺激来自正常供体或来自癌症患者的外周血的T细胞。用MR1基因转染这些肿瘤细胞系，从而在其质膜上表达大量的MR1蛋白。对活化的T细胞进行分选以表达活化标记物(例如CD137、或CD150、或CD69、或ICOS)，并根据公开文件(DeLibero，MethodsforthegenerationofTcellclonesandepithelialcelllinesfromexcisedhumanbiopsiesorneedleaspirates.InMHC123-140(IRL,Oxford；1997))。测试各个克隆的以MR1限制性方式识别肿瘤细胞、杀伤肿瘤细胞和释放炎性细胞因子的能力。对MR1限制性和肿瘤特异性T细胞克隆的TCR基因进行测序和识别。本专利技术还涉及根据我们先前建立的方案(DeLibero，同上)从相同的癌组织活检中制备肿瘤浸润性T细胞的方法。针对表达MR1蛋白的肿瘤细胞系测试各个T细胞克隆。研究了反应性最强的T细胞克隆的MR1限制性、肿瘤杀伤力和炎性细胞因子的释放。对所选T细胞克隆的TCR基因进行测序。具体实施方式本专利技术的第一方面涉及一种方法，该方法识别和分离表达T细胞受体的T细胞，所述T细胞受体能够特异性结合特定癌细胞抗原，该特定癌细胞抗原由与非多态性MHCI相关的MR1抗原呈递分子关联的癌细胞呈递。所述方法包含以下步骤：a.提供从患者或健康供体分离的T细胞制剂，然后b.在接触步骤中，在没有外源微生物衍生抗原的情况下，将该分离的T细胞制剂与表达MR1蛋白的癌细胞接触，特别是共培养，然后c.在分离步骤中以MR1依赖的方式将与所述癌细胞特异反应的T细胞分离。在非肿瘤患者的生理环境中，MR1呈递细菌核黄素副产物(以上称为“外源微生物衍生抗原”)，并将其呈递给粘膜恒定的T细胞。在某些实施方案中，接触步骤包括扩增步骤，其中分离的T细胞制剂在表达MR1的癌细胞存在下扩增。在某些特定实施方案中，照射癌细胞以便在本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分离表达T细胞受体的T细胞的方法，所述T细胞受体能够特异性结合由与MR1分子关联的癌细胞呈递的抗原，所述方法包含以下步骤：/na.提供T细胞制剂；然后/nb.在接触步骤中使所述T细胞制剂与表达MR1的癌细胞接触；/nc.在分离步骤中将与所述癌细胞特异性反应的T细胞分离。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170307 EP 17159754.5;20170703 EP 17179309.41.一种分离表达T细胞受体的T细胞的方法，所述T细胞受体能够特异性结合由与MR1分子关联的癌细胞呈递的抗原，所述方法包含以下步骤：
a.提供T细胞制剂；然后
b.在接触步骤中使所述T细胞制剂与表达MR1的癌细胞接触；
c.在分离步骤中将与所述癌细胞特异性反应的T细胞分离。


2.根据权利要求1所述的方法，其中所述接触步骤包含扩增步骤，其中所述分离的T细胞制剂在所述表达MR1的癌细胞的存在下扩增。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述扩增步骤在IL-2和/或IL-7和/或IL-15的存在下进行。


4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述分离步骤包含利用对CD3、CD69、CD137、CD150和/或ICOS的细胞表面标记物具有特异性的配体染色所述T细胞制剂，特别是其中所述分离步骤包括选定CD3+CD137+、和/或CD3+CD69+、和/或CD3+CD150+、和/或CD3+ICOS+T细胞，之后进行流式细胞术分析和细胞分选，特别是通过使用FACS或磁分离进行细胞分选。


5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述对细胞表面标记物具有特异性的配体是抗体或类抗体分子。


6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述分离步骤包含选定这样一种T细胞，当用表达MR1的细胞刺激时，与用不表达MR1的细胞刺激相比，其从选自IFN-γ和/或GM-CSF的细胞因子释放两倍的表达量。


7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括确定用于编码在所述分离步骤中分离的T细胞的T细胞受体的核酸序列。


8.一种制备表达T细胞受体的MR1T细胞制剂的方法，所述T细胞受体能够结合由与MR1分子关联的癌细胞呈递的抗原，所述方法包括以下步骤：
a.提供从患者获得的肿瘤样品；
b.将所述肿瘤样品与以下物质接触：
i.多个T细胞克隆，其中每个T细胞克隆的特征在于具有MR1T细胞受体，其能够特异性地结合由与MR1分子关联的癌细胞呈递的抗原；或者
ii.从MR1T细胞受体分子中分离的多个被标记和多聚化的可溶性TCR。
c.识别与所述肿瘤样品特异性反应的MR1T细胞受体；
d.提供T细胞制剂；
e.将一核酸表达构建体引入所述T细胞制剂从而产生转基因T细胞制剂，所述核酸构建体编码在所述T细胞克隆上表达的MR1反应性T细胞受体分子，其在步骤c中被识别出与所述肿瘤样品特异性反应。


9.根据权利要求8所述的方法，其中所述T细胞制剂是从同一患者处获得(自体过继性T细胞疗法)。


10.根据权利要求8所述的方法，其中所述T细胞制剂从另一个受试者获得，特别是HLA匹配的受试者(同种异体过继性T细胞疗法)。


11.根据权利要求8所述的方法，其中从所述患者获得的所述T细胞制剂是从患者的外周血中获得，特别是其中所述T细胞制剂是通过选定PBMC来表达一种或多种选自CD4、CD8、CD27、CD45RA和CD57的T细胞标记物获得的，特别是选定CD3+CD4+、或CD3+CD8+、或CD3+CD27+CD45RA+、或CD3+CD27+CD45RA-、或CD3+CD27-CD45RA-、或CD3+CD57-或CD3+CD57+T细胞。


12.根据权利要求8所述的方法，其中从所述患者获得的所述T细胞制剂是经过肿瘤活检接着体外扩增后获得。


13.一种通过权利要求8至12所述的任一方法获得的MR1特异性T细胞制剂，所述制剂用于治疗或预防癌症的方法，特别是治疗或预防通过MR1表达来表征的癌症的方法。


14.一种表达载体，所述表达载体包含编码以下物质的核酸序列：
a.功能性T细胞受体异二聚体；
或
b.T细胞受体α链，所述T细胞受体α链能够与T细胞受体β链一起形成功能性T细胞受体异二聚体；和/或
c.T细胞受体β链，所述T细胞受体β链能够与T细胞受体α链一起形成功能性T细胞受体异二聚体；
或
d.T细胞受体γ链，所述T细胞受体γ链能够与T细胞受体δ链一起形成功能性T细胞受体异二聚体；和/或
e.T细胞受体δ链，所述T细胞受体δ链能够与T细胞受体γ链一起形成功能性T细胞受体异二聚体，
其中所述T细胞受体异二聚体与MR1分子特异性结合，其中所述MR1分子在肿瘤细胞上表...

【专利技术属性】
技术研发人员：加纳罗·得利博罗，马尔科·莱波雷，露西娅·莫利，
申请(专利权)人：巴塞尔大学，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH