等位基因编辑及其应用制造技术

本发明专利技术涉及在真核细胞内测定同源定向修复(HDR)事件的方法，其中所述细胞表达表面蛋白的第一同种型，其与所述表面蛋白的第二同种型在氨基酸标志物方面不同。该方法包括以下步骤：诱导DNA双链断裂；提供HDR模板DNA修复构建体，其包含与表面蛋白的第二同种型对应的氨基酸标志物，和随后测定所述细胞上所述表面蛋白的所述第一或第二同种型的表达，其中所述第二同种型的表达表明成功的HDR事件。本发明专利技术还涉及在真核细胞内编辑目标基因组位置的方法，和在未编辑和编辑细胞的组合物中选择性耗尽或富集编辑细胞的方法。富集编辑细胞的方法。

【技术实现步骤摘要】
等位基因编辑及其应用
[0001]本申请是申请日为2017年04月25日，申请号为201780037736.8，专利技术名称为“等位基因编辑及其应用”的专利技术专利申请的分案申请。


[0002]本专利技术涉及在基因编辑，特别是CRISPR/Cas基因编辑期间监测和优化DNA双链断裂的同源定向修复效率的方法。本专利技术进一步涉及基于多重HDR富集已经历HDR的细胞的细胞制剂的方法，以及用于体外或体内选择性耗尽编辑细胞的方法。

技术介绍

[0003]基于CRISPR的基因工程是在细胞中引入基因组突变的灵活方式。通过使用与核酸酶复合的“可编程的”用户定义的短向导RNA，可以在所需的基因组位点处诱导双链DNA(dsDNA)断裂。经常使用的核酸酶包括Cas蛋白，特别是Cas9，但可以是其变体。变体包括具有改变的DNA结合特异性的改变的核酸酶，或添加了不同特征(例如转录激活或抑制或酶活性)以直接编辑核苷酸的融合蛋白。还可以修饰Cas核酸酶以诱导基因组DNA的单链“切口”。细胞对这些诱导的DNA断裂的应答是DNA修复机制的激活，其主要由非同源末端连接(NHEJ)途径和同源定向修复(HDR)途径组成。NHEJ通常导致随机插入和缺失(indel)，其可用于删除基因。这可用于实验目的，但是对于临床使用，固有的随机NHEJ修复途径具有显著的风险。靶向的精确基因编辑更安全，因此更令人满意。HDR途径通过基于DNA模板修复(ds)DNA断裂提供了引入精确突变的机会。然而，利用HDR途径进行生物技术目的的效率远低于利用NHEJ。NHEJ和HDR发生的比例为约9:1。克服低HDR效率的瓶颈是缺乏简单的系统来定量单个细胞中的NHEJ和HDR事件。用于评估基因编辑事件的许多测定是半定量的。对整个细胞群的测序不提供关于每个细胞的事件频率的信息，并且不允许区分纯合性与杂合性。尽管可以克隆细胞系以获得单个细胞信息，但是这种方法是繁琐的并且在原代细胞中是不可能的。替代性地，已经开发了基于流式细胞术的报告系统以定量基于单个细胞的基因编辑。然而，这样的系统依赖于对评估的细胞或生物体的遗传操作(大多数在其使用之前)，因此限制了它们的使用。
[0004]本专利技术所要解决的问题是提供一种简单的成本经济的系统，该系统允许快速的基于单个细胞的定量基因编辑事件，而不需要转基因，也不需要事先操作细胞。本专利技术的另一个问题是提供一种系统，其用于永久地标记和追踪细胞，并允许在体外或体内选择性地耗尽标记或未标记的细胞。这些问题由独立权利要求的主题解决。

技术实现思路

[0005]根据本专利技术的第一个方面，提供了测定第一同源定向修复(HDR)事件的方法。HDR事件发生在真核细胞的第一基因组位置。细胞表达第一表面蛋白的第一同种型(等位基因)，其与所述第一表面蛋白的第二同种型(等位基因)在氨基酸标志物方面不同，其中所述第一同种型包含由核酸序列A编码的氨基酸标志物A，所述第二同种型包含由核酸序列B编
码的氨基酸标志物B。第一基因组位置包含核酸序列A。方法包括以下步骤：
[0006]a.在所述第一基因组位置诱导第一DNA双链断裂；
[0007]b.提供第一DNA修复构建体，其包含所述核酸序列B和第一对同源臂(与所述第一基因组位置的5
’
和3
’
DNA序列同源)，特别是用所述第一DNA修复构建体转染所述细胞；
[0008]c.测定所述细胞上所述第一表面蛋白的第一和/或第二同种型的表达，并任选地，基于所述表面蛋白的第一和/或第二同种型的表达纯化所述细胞；和
[0009]d.测定所述第一HDR事件的发生，其中所述细胞上的所述第一表面蛋白的所述第二同种型的表达等于所述第一HDR事件的发生。
[0010]在本申请的上下文中，表述“细胞表面蛋白的第一和/或第二同种型”是指细胞表面蛋白的第一个和第二个等位基因。可以通过特异性结合各等位基因/同种型的配体来区分等位基因。在一些实施方案中，等位基因功能上相同。
[0011]在本申请的上下文中，表述“DNA修复构建体”是指用作模板以通过HDR在基因组DNA内修复DNA链损伤，尤其是双链断裂(DSB)的DNA构建体。DNA修复构建体包含同源臂和目标转基因序列。同源臂与DSB的5
’
和3
’
基因组DNA序列同源。目标转基因序列位于同源臂之间。在HDR修复基因组DNA期间，目标转基因序列插入基因组DNA。技术人员知晓，DNA修复构建体可以是线性(单链或双链)或环状(例如质粒、微环质粒)。
[0012]理想地，第一基因组位置(发生DSB的位置)对应于核酸序列A。如果这是不可行的(由于向导RNA设计的需要)，第一基因组位置也可以在核酸序列A的5
’
或3
’
方向的20bp内。如果这是不可行的(由于向导RNA设计的需要)，第一基因组位置也可以在核酸序列A的5
’
或3
’
方向的50bp内。当距离大于20bp，HDR效率显著下降。
[0013]在一些实施方案中，在至少两种不同实验条件下测定所述第一HDR事件的发生，与第二种实验条件相比，第一种实验条件下所述第二同种型与所述第一同种型的表达比增加表明所述第一实验条件下的HDR效率增加。
[0014]该系统能够快速的基于单个细胞的定量基因编辑事件，而不需要转基因，也不需要事先操作。因此，与需要多次操作以首先引入标志物系统所需的细胞系或细胞克隆相比，该系统可用于原代细胞。
[0015]在一些实施方案中，步骤a和b在包含香草醛和/或瑞卡帕布，尤其是浓度为50
‑
500μM的香草醛和/或0.5
‑
2.5μM的瑞卡帕布，更具体地约300μM的香草醛和/或约1μM的瑞卡帕布的细胞培养基中进行。
[0016]在本申请上下文中，香草醛是指4
‑
羟基
‑3‑
甲氧基苯甲醛，CAS No.121
‑
33
‑
5。
[0017]在本申请上下文中，瑞卡帕布是指8
‑
氟
‑2‑
{4
‑
[(甲氨基)甲基]苯基}
‑
1,3,4,5
‑
四氢
‑
6H
‑
氮杂并[5,4,3
‑
cd]吲哚
‑6‑
酮，CAS No.283173
‑
50
‑
2。
[0018]在一些实施方案中，可以通过分别特异性结合所述氨基酸标志物A和所述氨基酸标志物B的第一配体和第二配体区分第一表面蛋白的所述第一和第二同种型。
[0019]在本申请的上下文中，表述“特异性结合的配体”是指抗体或抗体样分子。
[0020]在本申请的上下文中，术语“抗体”以其在细胞生物学和免疫学领域中已知的含义使用，它是指完整抗体，包括但不限于免疫球蛋白G型(IgG)、A型(IgA)、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.编辑细胞在制备用于治疗或预防疾病的药物中的用途，其中在氨基酸标志物方面，所述编辑细胞中的基因组位置已经被编辑从表面蛋白的第一同种型变为所述表面蛋白的第二同种型，其中所述第一和第二同种型分别是天然和工程化同种型，并且可以通过分别与所述天然和工程化同种型特异性和选择性结合的两个不同配体区分，其中所述编辑细胞转移至所述宿主，其中选择性耗尽所述宿主未编辑细胞是基于所述表面蛋白的所述第一同种型的表达；其中选择性细胞耗尽通过抗体或抗体样分子实现。2.权利要求1所述的用途，其中所述第二同种型包含工程化的人工突变或稀有但天然存在的突变例如单核苷酸多态性，以改变内源表面蛋白的抗原性并提供改变的表位，从而通过识别天然表位但不识别所述改变的表位的配体使所述编辑细胞对耗尽有抗性。3.权利要求1所述的用途，其中对所述宿主细胞具有特异性的配体是选择性结合所述宿主未编辑细胞的抗体。4.权利要求1所述的用途，其中所述编辑细胞携带嵌合抗原受体(CAR)。5.权利要求1所述的用途，其中所述第二同种型是从天然CD19同种型改变而来的工程化CD19同种型，其具有CD19天然表位的改变表位。6.权利要求1所述的用途，其中所述第二同种型是从天然CD...

【专利技术属性】
技术研发人员：M，
申请(专利权)人：巴塞尔大学，
类型：发明
国别省市：