制备和分析血浆中的荧光化合物的方法技术

本文公开了一种用于分析患者血浆中荧光化合物浓度的方法。该方法包括从患者收集血浆样品，用溶剂稀释样品并通过HPLC分析稀释的样品。样品制备过程中样品不需要脱水，也不需要内标。

Methods for preparation and analysis of fluorescent compounds in plasma

A method for analyzing the concentration of fluorescent compounds in a patient's plasma is disclosed. The method includes collecting plasma samples from patients, diluting the samples with solvents and analyzing the diluted samples by HPLC. During sample preparation, the sample does not need to be dehydrated or internal standard.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】制备和分析血浆中的荧光化合物的方法相关申请的引证本申请要求2017年11月20日提交的美国临时申请序列号62/588,606的优先权权益，该申请的全部内容通过引用并入本文。
技术介绍
本专利技术的领域一般地涉及血浆中的荧光化合物的检测和定量。更具体地，本申请涉及分析和定量患者的血浆中的(2R,2'R)-2,2'-((3,6-二氨基吡嗪-2,5-二羰基)双(氮烷二基))双(3-羟基丙酸)的方法。在临床试验期间和之后经常需要对患者血浆中的小分子药物进行分析。在临床试验期间，有必要建立正确的药物剂量以优化功效并最小化不良副作用。在某些情况下，太少的药物(即，最小的功效和治疗效果)可能与太多(即，不良副作用)一样有害。肾小球滤过率(GFR)被广泛接受为患者中最可靠的肾功能量度。因此，存在对GFR的准确实时测量的医学需求，以评估由于急性或慢性肾损伤引起的肾功能。目前评估肾功能的常见临床实践测量血清肌酐水平及其24小时清除率，以基于Ferguson和Waikar或Inker等人的GFR方程获得估算的GFR(eGFR)。然而，由于合适的实验室处理样品所需的时间，该方法缺乏适当的灵敏度和准确性，同时具有时间延迟性。此外，结果根据诸如年龄、水合作用、肌肉质量和饮食等因素而有很大差异。外源性GFR示踪剂，如碘海醇如图1所示，提供有效的GFR评估。碘海醇不会在患者器官中代谢或汇集。其分布遵循穿过毛细血管的简单浓度梯度，并且通过简单的肾小球过滤完全消除，而没有肾小管肾分泌或重吸收。为了使用碘海醇进行GFR测定，在多个时间点从患者收集血液样品，然后进行仔细的实验室分析。使用WinNonlinPK/PD建模和模拟软件通过数据的PK分析确定GFR值。这是一个劳动密集型过程，对医疗和实验室人员提出了很高的要求。它还需要延长的时间，因为除了之后要求的实验室分析之外，必须在几个小时内收集多个样品。慢性肾病(CKD)是一种医学病症，其特征在于肾功能随时间逐渐丧失。它包括损害肾脏的病症，并降低其从个体血流中正确去除废物的能力。CKD的并发症包括高血压、贫血(低血细胞计数)、骨弱(骨质薄弱)、营养不良、神经损伤和心脏病风险增加。根据国家肾脏基金会的统计，大约全部CKD病例的三分之二是由糖尿病或高血压引起的。除家族史外，肾脏疾病的其他风险因子包括年龄、种族、高血压和糖尿病。GFR是确定肾功能水平和评估患者CKD分期的最佳测试。GFR是确定肾功能水平(其确定CKD分期)的重要测试。如下所示，患者的GFR越低，CKD越严重。已经进行了很多努力以寻找可以实时透皮检测的外源性荧光剂。参见US9,480,687、US9,114,160、US8,722,685、US8,115,000和US8,778,309的教导；其各自的全部内容通过引用并入本文。除了许多其他小分子外，还合成了具有优异的光物理性质和其他化学和物理特性的荧光化合物MB-102。MB-102，(2R,2'R)-2,2'-((3,6-二氨基吡嗪-2,5-二羰基)双(氮烷二基))双(3-羟基丙酸)是，如图1所示，正在开发的用于实时GFR测定的荧光剂。当激发434nm时，它在556nm处发出强荧光信号，目前正在进行人体临床研究。值得注意的是，可以透皮地实时测量在患者血流中循环的MB-102的量和它通过肾小球滤过消除的速率。这消除了对耗时的样品收集和实验室分析的需要，同时为医务人员提供患者肾功能的实时评估。因此，需要验证用于量化患者的血浆或血流中的MB-102的量的方法的准确性。血浆样品的实验室分析通常涉及蛋白质沉淀、蒸发和干燥，然后在与HPLC相容的溶剂中重构(复配，reconstitution)。这是一个劳动密集型过程，并延长了获得结果之前所需的时间。蛋白质沉淀方法的另一个缺点是需要样品中的内标以确保准确的结果。这些步骤延长了分析所需的时间并引入了错误的机会。因此，需要缩短分析所需的时间并减少错误的机会。
技术实现思路
在一个方面，本文公开了一种用于测量血浆中的荧光化合物的量的方法。该方法包括收集血浆样品，用至少一种溶剂稀释血浆样品，并通过HPLC分析稀释的样品，从而测量血浆中化合物的量。在HPLC分析之前不干燥血浆样品，并且不向样品中添加内标。在另一个方面，本文公开了一种用于测量血浆中的荧光化合物的量的方法。该方法包括从患者收集血浆样品，向样品中加入至少一种溶剂，从而使血浆蛋白沉淀，从样品中除去沉淀的血浆蛋白，并通过HPLC分析样品，从而测量血浆中的化合物的量。在HPLC分析之前不干燥样品，并且不向样品中添加内标。附图说明图1示出了MB-102和碘海醇的结构。图2是1％血浆/PBS中MB-102在3.3ng/mL下与对照空白(1％血浆/PBS)的HPLC色谱图的叠加图。图3A和3B示出了对于两种不同样品，在1％血浆/PBS中在0.4ng/mL下的MB-102的信号/噪声、USP拖尾因子和USP平板计数。图4是掺入(加标，spike)1XPBS中的MB-102的峰纯度。图5是标准样品制备后血浆样品中的MB-102的峰纯度。图6是GMP合同实验室对照内部评估测试的，从患者获得的血浆中MB-102的相关性图。图7是来自临床试验的12名患者的MB-102的药代动力学分析。图8a、8b和8c是比较临床试验中三名患者的MB-102和碘海醇的清除率的图表。图9是使用直接稀释或蛋白质沉淀测试的血浆中的MB-102的相关性图。图10是通过内部测试对照GMP合同实验室测试的样品直接稀释测试的血浆中的MB-102浓度的相关性图。图11是通过直接稀释和蛋白质沉淀测试的显示溶血的血浆样品中的MB-102浓度(血红蛋白水平为50mg/dL至100mg/dL)的相关性图。图12是通过直接稀释和沉淀测试的显示溶血的血浆样品中的MB-120浓度(血红蛋白水平为100mg/dL至250mg/dL)的相关性图。具体实施方式本文公开了一种用于监测有此需要的患者中的荧光化合物浓度的方法。该方法包括收集血浆样品，用至少一种溶剂稀释血浆样品，并通过高压液相色谱(HPLC)分析稀释的样品。重要的是，样品在分析前未进行干燥，样品制备过程中也未添加内标。在一些实施方案中，荧光化合物是如本文其他地方公开的式I化合物。优选地，化合物是(2R,2'R)-2,2'-((3,6-二氨基吡嗪-2,5-二羰基)双(氮烷二基))双(3-羟基丙酸)(MB-102)，或其药学上可接受的盐，如下所示：在一些实施方案中，通过从患者收集血液样品来制备血浆样品，并使用本领域已知的方法收集血浆。可以从人类患者、动物或体外研究中收集血浆。可以收集血浆的动物的实例包括但不限于狗、猫、牛、马、猪、山羊、猴子、大鼠和小鼠。优选地，从人类患者收集血浆。可以立即分析血浆中的荧光化合物，或者可以将其储存以便在后续时间段进行分析。如果储存血浆样品以便在后续时间段进行分析，则进行样品储存以使分解本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于测量血浆中的荧光化合物的量的方法，所述方法包括：/n收集血浆样品，/n用至少一种溶剂稀释所述血浆样品；和/n通过HPLC分析稀释的所述样品，从而测量所述血浆中的所述化合物的量；/n其中在HPLC分析之前不干燥所述血浆样品，并且不向所述样品中添加内标。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171120 US 62/588,6061.一种用于测量血浆中的荧光化合物的量的方法，所述方法包括：
收集血浆样品，
用至少一种溶剂稀释所述血浆样品；和
通过HPLC分析稀释的所述样品，从而测量所述血浆中的所述化合物的量；
其中在HPLC分析之前不干燥所述血浆样品，并且不向所述样品中添加内标。


2.根据权利要求1所述的方法，其中所述荧光化合物是式I的化合物或其药学上可接受的盐，其中



X1和X2各自独立地为–CO2R1、–CONR1R2、–CO(AA)或–CONH(PS)；
Y1和Y2各自独立地选自–NR1R2和



Z1为单键、–CR1R2–、–O–、–NR1–、–NCOR1–、–S–、–SO–或–SO2–；
R1至R2各自独立地选自H、–CH2(CHOH)aH、–CH2(CHOH)aCH3、–CH2(CHOH)aCO2H、–(CHCO2H)aCO2H、–(CH2CH2O)cH、–(CH2CH2O)cCH3、–(CH2)aSO3H、–(CH2)aSO3-、–(CH2)aSO2H、–(CH2)aSO2-、–(CH2)aNHSO3H、–(CH2)aNHSO3-、–(CH2)aNHSO2H、–(CH2)aNHSO2-、–(CH2)aPO4H3、–(CH2)aPO4H2-、–(CH2)aPO4H2-、–(CH2)aPO43-、–(CH2)aPO3H2、–(CH2)aPO3H-和–(CH2)aPO32-；
AA是包含选自天然和非天然氨基酸的一个或多个氨基酸的肽链，所述一个或多个氨基酸通过肽或酰胺键连接在一起，并且每种情况的AA可与每种其他情况相同或不同；
PS是硫酸化或非硫酸化的多糖链，其包含通过糖苷键连接的一个或多个单糖单元；且
“a”是1至10的数字，“c”是1至100的数字，“m”和“n”中的每一个独立地是1至3的数字。


3.根据权利要求2所述的方法，其中所述化合物是



或其药学上可接受的盐。


4.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种溶剂选自水性溶剂、非水性溶剂及其任何组合。


5.根据权利要求4所述的方法，其中所述至少一种溶剂是PBS。


6.根据权利要求1所述的方法，其中所述血浆样品显示出血液溶血的迹象。


7.一种用于测量血浆中的荧光化合物的量的方法，所述方法包括：
收集血浆样品，
向所述样品中加入至少一种溶剂，从而使血浆蛋白沉淀，
从所述样品中去除沉淀的所述血浆蛋白，和
通过HPLC分析所述样品，从而测量所述血浆中的所述化合物的量；
其中在HPLC分析之前不干燥所述样品，并且不向所述样品添加内标。


8.根据权利要求7所述的方法，其中去除沉淀的所述血浆蛋白包括离心所述样品，
离心的所述样品具有上清液和沉淀物；并且
在HPLC分析之前，用至少一种溶剂稀释所述上清液。


9.根据权利要求7所述的方法，其中所述至少一种溶剂选自甲醇、PBS及其任何组合。


10.根据权利要求7所述的方法，其中所述荧光化合物是式I的化合物或其药学上可接受的盐，其中



X1和X2各自独立地为–CO2R...

【专利技术属性】
技术研发人员：杰格·J·希霍，
申请(专利权)人：麦迪贝肯有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US