一种检测氨苄青霉素的生物传感器及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及生物传感器技术领域，特别涉及基于杂交连锁反应放大的荧光生物传感器。为了解决以上现有技术中检测氨苄青霉素的方法特异性和灵敏度都比较低、成本高的问题。一种基于核酸适配体检测氨苄青霉素的生物传感器，将切刻内切酶Nb.BbcCI与链杂交连锁反应的配合实现循环放大作用，以及硫黄素T与G‑四联体结合产生荧光，均相反应混合液。制备方法：制备金纳米粒子；将Walker与Track修饰到金纳米粒子表面；将标记的纳米金溶液与均相反应溶液混合；超支化杂交连锁反应、荧光检测；利用了核酸适配体的特异型识别，利用核酸适配体对目标物氨苄青霉素的高特异性检测；利用超支化杂交连锁反应放大，实现信号放大的作用。

A biosensor for the detection of ampicillin and its preparation and Application

The invention relates to the technical field of biosensor, in particular to a fluorescent biosensor based on hybrid chain reaction amplification. In order to solve the problems of low specificity and sensitivity and high cost in the above existing technology. A biosensor for the detection of ampicillin based on aptamer of nucleic acid, which can realize the cyclic amplification by the combination of cutting endonuclease nb.bcci and chain hybrid chain reaction, and produce fluorescence by the combination of Thioflavin T and G \u2011 tetramer, a homogeneous reaction mixture. Preparation methods: preparation of gold nanoparticles; modification of Walker and track on the surface of gold nanoparticles; mixing of labeled gold nanoparticles with homogeneous reaction solution; hyperbranched hybridization chain reaction and fluorescence detection; specific recognition of aptamer, high-specific detection of ampicillin by aptamer; amplification by Hyperbranched hybridization chain reaction To realize the function of signal amplification.

【技术实现步骤摘要】
一种检测氨苄青霉素的生物传感器及其制备方法和应用
本专利技术涉及生物传感器
，特别涉及一种检测氨苄青霉素的生物传感器及其制备方法和应用。
技术介绍
氨苄青霉素（ampicillin,AMP）是β－内酰胺类抗生素的一种，是在青霉素Ｇ侧链羧基α位引入氨基，改变其极性的半合成青霉素。氨苄青霉素耐酸不耐酶，克服了天然青霉素不宜内服的缺点，因此在畜牧养殖过程中常作为消炎抗感染的首选药物，对革兰氏阴性菌和阳性菌均可产生不同程度的抑制作用。目前，在氨苄青霉素的分析方法中，常用的AMP检测方法有高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、液相-质谱联用法（LC-MS）等，这些方法存在过程繁琐、仪器昂贵和操作复杂等缺点有必要建立更可靠的快速分析方法；免疫分析法（IAs）近年来应用日趋广泛，但由于AMP是小分子化合物，存在抗体质量不稳定、方法特异性差等问题，限制了IAs法的普及；因此，需要探寻一种快速、准确、灵敏、操作简单、且特异性高的检测方法来检测氨苄青霉素。适配体（Aptamer）是一类能以较高亲和力与各类靶分子，特异性地结合的单链寡核苷酸（DNA、RNA、修饰RNA）。Aptamer与各种靶分子结合是基于单链核酸结构和空间构象的多样性，它可通过链内某些互补碱基间的配对以及静电作用、氢键作用等自身发生适应性折叠，形成一些稳定的三维空间结构，绑定于其靶分子上，从而通常对其靶分子显示出非常高度的亲和力。
技术实现思路
为了解决以上现有技术中检测氨苄青霉素的方法操作繁琐，费时费力，样品的前处理或浓缩过程繁琐，仪器昂贵难以普及的问题，本专利技术提供了一种特异性强、亲和力高、结合的目标物质种类多、分子量较小以及合成过程简便的基于DNAWalker的超支化杂交连锁反应用于氨苄青霉素的超灵敏检测的生物传感器，还涉及其制备方法与应用。一种检测氨苄青霉素的生物传感器，包括底物探针标记的金纳米粒子与均相反应液；所述的均相反应液包括：灭菌水、目标物、HAP1、HAP2、HAP3、HAP4、10×的缓冲液buffer、切刻内切酶Nb.BbcCI、ThT；所述的底物探针是由Walkker、Aptamer和Track形成，且Walkker和Track均含-SH；所述的Walker序列如SEQNo.1所示；所述的Aptamer序列如SEQNo.2所示；所述的Track序列如SEQNo.3所示；所述的HAP1序列如SEQNo.4所示；所述的HAP2序列如SEQNo.5所示；所述的HAP3序列如SEQNo.6所示；所述的HAP4序列如SEQNo.7所示。上述生物传感器的制备方法，包括以下步骤：（1）制备金纳米颗粒溶液；（2）底物探针标记金纳米粒子；（3）将标记的纳米金溶液与均相反应溶液混合；（4）杂交连锁反应、荧光检测；所述步骤（1）的金纳米颗粒溶液的制备步骤如下：（1）取500μL0.04g/mlHAuCl4加入200ml超纯水中，搅拌加热煮沸；（2）搅拌下，快速加入3ml1%的柠檬酸三钠溶液，溶液颜色由浅黄色变为酒红色，继续加热15min后，慢慢冷却至室温，得到金纳米颗粒溶液，至于4℃保存备用；（3）使用紫外分光光度计，计算出金纳米颗粒溶液的浓度约为0.3nM。所述步骤（2）的底物探针标记金纳米粒子，操作步骤如下：（1）将Walker与Aptamer按照1：1的比例混合在一起，加入PBS缓冲液，室温下反应2h。（2）将上述反应好的含-SH的Walkker和含-SH的Track按照1:20的比例混合，形成底物探针；（3）浓缩纳米金溶液至3nM，移入1mL玻璃瓶中，用锡箔纸封口；（4）按照纳米金与底物探针的浓度比1：5000混合均匀，4℃下放置24h；（5）分多次缓慢加入50μLPB缓冲液，搅拌10min后，继续加入27μLPBS缓冲液；4℃放置48h；（6）洗脱未标记上的DNA链，既得底物探针标记金纳米粒子。所述步骤（3）的均相反应液包括：灭菌水、目标物、HAP1、HAP2、HAP3、HAP4、10×的缓冲液buffer、切刻内切酶Nb.BbcCI、ThT。所述的步骤（4）杂交连锁反应温度为37℃，时间是2h。上述生物传感器在检测食品及水体中氨苄青霉素上的应用。均相中发生的反应主要有：Walker与Aptamer进行碱基互补配对形成双链结构。当有氨苄青霉素存在时，Aptamer与氨苄青霉素进行结合，同时使得Walker释放。释放出的Walker可以与Track的部分进行碱基互补配对，在切刻内切酶Nb.BbcCI存在下进行剪切，Primer片段从双链中剪切下来，同时释放出剩余部分的Track链，Walker又可以进一步与另一个Track结合重复这一步骤。此外，产生的Primer能够打开HAP1，打开的HAP1可以打开HAP2和HAP3，打开的HAP2可以打开HAP1，打开的HAP3可以打开HAP4，打开的HAP4可以打开HAP3，以此延续下去。翘起来的5’和3’可以与硫黄素T结合生成G-四联体序列，并产生荧光信号。本专利技术中一共用到了7条DNA链，其序列分别是：Walker：5’-SH-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCGCTATACCCTCAGCCCGCCCGC-3’Aptamer:5’-GCGGGCGGTTGTATAGCGG-3’Track：5’-SH-TTTTTTTTTTCGTCCGTGCTGAGGGATTCGGACG--3’HAP1：5’-CGTCCGAATCCCTCACCCACCCATAACGGGGTCAGCATACTGTGAGGGA-3’HAP2：5’-TGAGGGATTCGGACGTCCCTCACAGTATGAAAGTTAC-3’HAP3：5’-GGGTGGGTCAGAGTTATCACTTTGAGATAACTCTGACCCCGTTATGGGTGGG-3’HAP4：5’-TCAAAGTGATAACTCTGTAACGGGGTCAGAGTT-3’Walker的5’端修饰-SH，通过Aμ-S共价键将Walker修饰到纳米金表面，其中的斜体部分序列可以与Aptamer的斜体部分序列互补。Track的5’端修饰-SH，通过Aμ-S共价键将Track修饰到纳米金表面，其中Track的下划线部分的序列可以与Walker的带有下划线部分的序列互补，并且Walker与Track杂交部分中间含有切刻内切酶的切刻序列，可以被切刻内切酶Nb.BbcCI切割，释放出加粗部分（Primer）。Primer可以打开HAP1中的加粗部分，与之序列互补配对，HAP1的斜体部分可以打开HAP2的斜体部分，与之序列互补配对，HAP2的加粗部分可以与HAP1的加粗部分，与之序列互补配对，，HAP1的下划线部分可以打开HAP3的下划线部分，与之序列互补配对，HAP3的斜体部分可以打开HAP4的斜体部分，与之序列互补配对，HAP4的加粗部分可以打开HAP3的加粗部分，与之序列互补配对。在这个过程中，HAP3的5’和3’端分别都被翘起，在加入硫黄素T后，翘起部分可以与硫黄素T结合生成G-四联体序列，并产生荧光信号。本专利技术中氨苄青霉素的检测是在均相溶液中实现的，通过杂交连锁反应的方式实现信号放大，从而实现氨苄青霉素的高灵敏检测，并获得较低的检测下本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测氨苄青霉素的生物传感器，其特征在于，包括底物探针标记的金纳米粒子及均相反应液；所述的均相反应液包括：灭菌水、目标物、HAP1、HAP2、HAP3、HAP4、10×的缓冲液buffer、切刻内切酶Nb.BbcCI、ThT；所述的底物探针是由Walkker、Aptamer和Track形成，且Walkker和Track均含‑SH；所述的Walker序列如SEQ No.1所示；所述的Aptamer序列如SEQ No.2所示；所述的Track序列如SEQ No.3所示；所述的HAP1序列如SEQ No.4所示；所述的HAP2序列如SEQ No.5所示；所述的HAP3序列如SEQ No.6所示；所述的HAP4序列如SEQ No.7所示。

【技术特征摘要】
1.一种检测氨苄青霉素的生物传感器，其特征在于，包括底物探针标记的金纳米粒子及均相反应液；所述的均相反应液包括：灭菌水、目标物、HAP1、HAP2、HAP3、HAP4、10×的缓冲液buffer、切刻内切酶Nb.BbcCI、ThT；所述的底物探针是由Walkker、Aptamer和Track形成，且Walkker和Track均含-SH；所述的Walker序列如SEQNo.1所示；所述的Aptamer序列如SEQNo.2所示；所述的Track序列如SEQNo.3所示；所述的HAP1序列如SEQNo.4所示；所述的HAP2序列如SEQNo.5所示；所述的HAP3序列如SEQNo.6所示；所述的HAP4序列如SEQNo.7所示。2.一种权利要求1所述的生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）制备金纳米颗粒溶液；（2）底物探针标记金纳米粒子；（3）将标记的纳米金溶液与均相反应溶液混合；（4）杂交连锁反应、荧光检测；所述步骤（3）的均相反应液包括：灭菌水、目标物、HAP1、HAP2、HAP3、HAP4、10×的缓冲液buffer、切刻内切酶Nb.BbcCI、ThT。3.根据权利要求2所述的的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）的金纳米颗粒溶液的制备步骤如下：（1）取500μL0.04g/mlH...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘素，瞿晓南，黄加栋，王玉，张儒峰，赵一菡，李莎莎，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：山东,37