单细胞分析制造技术

本发明专利技术涉及用于从单细胞中条形码化核酸的方法和用于对具有感兴趣表型的单细胞进行基因分型的方法。

Single cell analysis

The invention relates to a method for barcoding nucleic acids from a single cell and a method for genotyping a single cell with a phenotype of interest.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】单细胞分析
本专利技术涉及用于从单细胞中条形码化(barcoding)核酸的方法以及用于对具有感兴趣表型的单细胞进行基因分型的方法。
技术介绍
用于分析群中单细胞的多个参数的方法在各种情况下都是令人感兴趣的。特别是，商业和学术实验室广泛关注在细胞群内基于单细胞分析核酸(任选地与一种或多种其他参数组合)的能力。而且，这种分析通常需要实时进行，以揭示生物学和生物化学过程的动态行为。因而，需要能够以高度并行的方式分离、检测和定量异质混合物的个体组分的技术来满足这些挑战。已开发了常规的高通量平台，例如具有机器人分配系统的高密度微孔板，并将其广泛用于高通量分析，如药物筛选。然而，其需要昂贵且笨重的机器人机器并且需要对样品进行蒸发和相当大的反应体积，这会浪费宝贵的生物样品或试剂。最近，微制造装置(microfabricateddevice)已经成为用于以高通量方式进行各种生物学和化学测定的强大实验平台。这些技术通常允许通过将大量溶液分配到很多分离的皮升至纳升大小的隔室或微反应器中来对复杂样品进行高通量分析。然而，对个体样品进行分析后恢复(retrieval)是难以实现的。此外，在这些装置中混合试剂或者需要复杂的结构，或者通常在区室化之前大量进行，其可以防止初始反应产物与其引发靶点共定位。一种方法是将反应区室化成由不混溶的载体流体包围的离散的微米尺寸的液滴。基于液滴的微流体可精确控制流体混合，最大限度地减少贵重试剂的浪费以及减少分子在设备壁上的蒸发和吸附。White等(ProcNatlAcadSciUSA.2011Aug23；108(34):13999-4004)描述了一种微流体装置，其能够在每次运行时对数百个单细胞的基因表达进行RT-qPCR测量，执行单细胞处理，包括细胞捕获、细胞裂解、逆转录和定量PCR。然而，为了试图尝试更小的反应体积，White等(ProcNatlAcadSciUSA.2011Aug23；108(34):13999-4004)进行了300次平行的RT-qPCR并证实了在所检测的反应条件下当体积小于5nL时RT被抑制。因此，研究者以每个细胞67nL进行RT反应并进一步声称在单个反应中RT与qPCR的组合排除了大规模转录组分析和/或无偏差扩增。此外，DeKosky等(NatMed.2015Jan；21(1):86-91)针对单细胞mRNA捕获已经描述了一种使用简单的轴对称流动聚焦装置的方法。该方法的RT和PCR反应在乳液中进行。已证明该方法是有效的，但是需要进行顺序的3个步骤方法。沿着同一主线，Eastburn等(AnalChem.2013Aug20；85(16):8016-21)在小液滴体积中进行RT，但是耗时3-4个步骤。他还提到了细胞蛋白酶在小体积中的RT抑制作用。为了解决这一问题，他们使用蛋白酶处理细胞、稀释细胞裂解物、分裂液滴和皮注射RT-PCR试剂。Rotem等(PLoSOne.2015May22；10(5):e0116328)将寡核苷酸包封在液滴群中并将其与含有细胞的液滴融合，同时皮注射RT酶和缓冲液。这3个步骤方法产生了～100pL液滴，允许在3h包封100.000个细胞。尽管这种方法依赖于单细胞cDNA标记，但转录组序列数据来自于多个表型和基因型不相关细胞的聚集体。Macosko等(Cell.2015May21；161(5):1202-14)使用基于液滴的微流体以将细胞与裂解试剂和条形码化的珠子包封在一起，以捕获1nL液滴中的mRNA。然而，在芯片外使用珠子以将珠子上捕获的mRNA转化成cDNA，并且其不会负载在大部分已形成的液滴上，从而排除了稀有细胞群的分析。Macosko等描述的该方法的第3步是然后致力于文库制备和扩增。国际专利申请WO2015/164212涉及一种用于包封和条形码化单细胞核酸的方法。WO2015/164212公开了在小于3nL的体积中mRNA的RT被强烈抑制(WO2015/164212的实施例4)。Labanieh等2015描述了一种微流体方法，其使用微流体芯片利用浮力捕获、分析和回收液滴。然而，Labanieh等没有明确指出其中核酸被逆转录的单细胞核酸的分析，并且因此无法使用该方法获得单细胞的基因型。专利申请US2013/0323732涉及用于测定单细胞和将单细胞cDNA条形码化的方法和装置。US2013/0323732没有公开其中液滴在微流体芯片内融合的方法。与此相反的是，本专利技术人成功开发了一种用于将单细胞核酸条形码化的在芯片上的微流体方法，其中将单细胞液滴捕获在个体的隔室中。再进一步将单细胞液滴与提供用于逆转录的反应混合物的液滴融合。如上所述，本专利技术人开发的在芯片上的方法允许获得单细胞的表型。因此，本专利技术人进一步开发了一种独特的将表型信息(蛋白表达水平、细胞通路激活/活性、离子通道/GPCR活性)与基因型或表观遗传信息偶联的方法，从而允许确定具有感兴趣表型的单细胞的基因型。在该方法各个步骤中对阵列成像的能力允许与常规方法相比获得每个单细胞更多的定量数据并且允许在表型筛选期间产生动力学数据，然后可以将其与特定单细胞的基因型联系起来。该方法不同于到目前为止已知的现有技术，例如Rotem等，因为例如在Rotem等中基因组信息是通过对多个表型和基因型不相关细胞的聚集体进行测序而获得的。因此，他们的方法没有公开将每个单细胞的表型信息与基因型信息偶联在一起。国际专利申请WO2016145409Al公开了一种方法，其中感兴趣蛋白的表型和基因型可以是相关的。与本专利技术人的方法不同，在该方法中，将条形码与例如感兴趣的蛋白或其结合配偶体连接，并且在同时与编码所述感兴趣的蛋白的核酸连接。然后，将核酸逆转录以获得条形码化的cDNA，之后再对条形码化的cDNA测序。通过破坏乳液并进行表型测定，例如ELISA或使用亲和柱的测定，平行地对感兴趣的蛋白进行表型分型。对于显示出所期望的表型的蛋白，然后可以通过测序对条形码序列进行分析。随后，通过将具有感兴趣表型的感兴趣蛋白的条形码与具有相同条形码的cDNA匹配将表型与基因型联系起来。然而，本领域技术人员将意识到的是，这样的方法不允许将单细胞的整个转录组与单细胞的表型相匹配，或者不能获得具有与存在的一种特定的感兴趣蛋白无关的表型的单细胞的基因型。与此相反的是，本专利技术人的方法允许在一个步骤中对几种单细胞进行表型分型，然后通过混合其核酸平行地对那些单细胞进行基因分型。随后，将基因组信息与具有感兴趣表型的单细胞的表型联系起来。此外，本专利技术人的方法允许确定任何表型，包括不一定与存在的感兴趣的单个蛋白相关的表型，但其可以与例如某些通路的活性改变相关，并且所述改变导致可以使用测定确定的任何表型，例如抗体分泌速率、离子通道活性、GPC活化、细胞的氧化还原电位改变。
技术实现思路
本专利技术的第一个方面涉及一种用于对具有感兴趣表型的单细胞进行基因分型的方法，所述方法包括：-提供多个储库，和a)对于多个储库，针对各个储库提供至少一种条形码序列和至少一种染料，其中所述至少一种条形码序列与所述至少一种染料的颜色和浓度相关，并获取阵列的图像，从而为各个储库映射(mapping)所述至少一种染料的所述颜色和所强度；和b)对于多个储库，针对各个储库提供至少一个单细本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于对具有感兴趣表型的单细胞进行基因分型的方法，所述方法包括：‑提供多个储库，和a)对于多个储库，针对各个储库提供至少一种条形码序列和至少一种染料，其中所述至少一种条形码序列与所述至少一种染料的颜色和浓度相关，并获取阵列的图像，从而为各个储库映射所述至少一种染料的所述颜色和强度；和b)对于多个储库，针对各个储库提供至少一个单细胞并针对各个储库在所述至少一个单细胞上进行表型测定，并获取图像，从而为各个储库映射所述至少一个单细胞的所述表型；其中步骤a)在步骤b)之前进行或者步骤b)在步骤a)之前进行；然后c)对于多个储库，针对各个储库将在步骤b)中获得的所述单细胞的表型与在步骤a)中获得的所述至少一种染料的所述颜色和所述强度联系起来；和‑对于多个储库，针对各个储库将所述至少一个单细胞的核酸逆转录以获得用所述至少一种条形码序列条形码化的单细胞cDNA，所述至少一种条形码序列与所述至少一种染料的所述颜色和浓度相关；和‑将所述基因型与所述至少一个单细胞的所述表型联系起来。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2017.03.17 EP 17305297.81.一种用于对具有感兴趣表型的单细胞进行基因分型的方法，所述方法包括：-提供多个储库，和a)对于多个储库，针对各个储库提供至少一种条形码序列和至少一种染料，其中所述至少一种条形码序列与所述至少一种染料的颜色和浓度相关，并获取阵列的图像，从而为各个储库映射所述至少一种染料的所述颜色和强度；和b)对于多个储库，针对各个储库提供至少一个单细胞并针对各个储库在所述至少一个单细胞上进行表型测定，并获取图像，从而为各个储库映射所述至少一个单细胞的所述表型；其中步骤a)在步骤b)之前进行或者步骤b)在步骤a)之前进行；然后c)对于多个储库，针对各个储库将在步骤b)中获得的所述单细胞的表型与在步骤a)中获得的所述至少一种染料的所述颜色和所述强度联系起来；和-对于多个储库，针对各个储库将所述至少一个单细胞的核酸逆转录以获得用所述至少一种条形码序列条形码化的单细胞cDNA，所述至少一种条形码序列与所述至少一种染料的所述颜色和浓度相关；和-将所述基因型与所述至少一个单细胞的所述表型联系起来。2.根据权利要求1所述的微流体方法，其中所述方法还包括选自以下的至少一个步骤：-至少一个清除步骤，-对于多个储库，针对各个储库提供至少一种寡核苷酸，其中所述至少一种寡核苷酸包含引物序列，-对于多个储库，针对各个储库将所述至少一种条形码序列附接至所述至少一种寡核苷酸，-对于多个储库，针对各个储库提供裂解组合物，-对于多个储库，针对各个储库裂解所述至少一个单细胞，-对于多个储库，针对各个储库提供逆转录酶和逆转录酶组合物，-对于多个储库，针对各个储库将所述单细胞核酸的至少一些与至少一种条形码化的寡核苷酸杂交，-回收所述条形码化的单细胞cDNA，-从所述条形码化的cDNA中除去未掺入的寡核苷酸，-扩增所述条形码化的单细胞cDNA，-对所述条形码化的单细胞cDNA进行测序。3.根据权利要求1或2所述的微流体方法，其中所述方法是包括提供微粒体装置的步骤的微流体方法，所述微流体装置包含芯片，所述芯片包含至少一个微流体通道和多个储库。4.根据权利要求3所述的微流体方法，其中，针对各个储库，在单细胞液滴中提供所述至少一个单细胞。5.根据权利要求3或4所述的微流体方法，其中，针对各个储库，在RT液滴中提供所述逆转录酶、所述逆转录酶组合物和所述至少一种寡核苷酸。6.根据权利要求1至5中任一项所述的微流体方法，其中，对于多个储库，将所述至少一种条形码序列连接在所述多个储库的各个储库的表面上。7.根据权利要求6所述的微流体方法，其中在转录前释放所述至少一种条形码序列。8.一种用于条形码化单细胞核酸的微流体方法，所述方法包括：-提供微流体装置，所述微流体装置包含芯片，所述芯片包含至少一个微流体通道和多个储库，-向所述微流体通道的入口注入载体流体，所述载体流体包含分散在所述载体流体中的多个第一类型的液滴，其中...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·赖晨，A·赖茨，沈冰清，S·埃卢泽，A·杰拉德，
申请(专利权)人：高保真生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：法国,FR