单细胞分析的微流控方法技术

本发明专利技术的第一个方面涉及在微流体系统中检测目标化合物的方法。本发明专利技术的第二个方面涉及根据第一个方面的方法的应用，用于监测生物事件。本发明专利技术的另一个方面涉及微流体系统及其应用，用于实施根据第一个方面的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】单细胞分析的微流控方法
本专利技术涉及细胞和分子生物学领域，并且基于用于检测在液滴中由单个细胞产生的目标化合物的方法。本专利技术还涉及微流体领域，并且包括微流体装置及微流体装置在进行生物学测定中的用途。
技术介绍
在药物发现过程中，步骤之一与基于候选药物的预期生物学作用对候选药物进行验证有关。为此，可以使用体内或体外模型。一方面，体内实验具有解决整个生物体问题的优势。但是，动物模型并不一定能预测人类会发生什么。而且，体内研究是昂贵的，并且其使用受到伦理考虑的限制。另一方面，即使不能复制生物体的精确细胞状态，体外系统也可以对人细胞进行，并且特别适用于需要高通量的筛选过程。这些基于细胞的分析通常对目标细胞进行。但是，在某些情况下，如免疫细胞一样，它们中的每一个都是独特的，因此在单个细胞水平上基于功能性细胞的检测的需求引起了极大的兴趣。实际上，在大量人群中测量免疫应答会增加掩盖每个单个细胞独特行为或贡献的风险，尤其是在免疫应答高度异源或由稀有细胞种群驱动时。因此，需要基于单细胞的分析方法，以更好地了解考虑单个细胞表型的不同细胞之间的潜在差异。单细胞分析方法的最新进展通过表征种群内细胞之间的关系，改善了单细胞内的生物学理解。因此，通过确定罕见的细胞事件或单个细胞之间的微小变化，有可能解决癌症、免疫学、传染病、干细胞以及发育生物学和神经病学领域尚未解决的问题。免疫细胞通过产生抗体、趋化因子和细胞因子来保护宿主生物免受疾病侵害。前一类分子是先天性和适应性免疫细胞作为化学信使分泌的一组蛋白质。免疫细胞产生它们的原因是人体能够增强免疫反应，因此具有很高的临床诊断价值。因此，抗体和细胞因子分泌动力学的研究均可为疾病诊断和个性化治疗提供重要信息。然而，缺乏用于分析单个分泌细胞的定量、单细胞、高通量系统限制了对免疫反应动力学的研究。近来，基于液滴的微流体系统由于其在细胞生物学中的应用范围以及基于其在单细胞水平上控制机械、生物和流体环境的能力而引起了极大的兴趣。该技术使测定能够非常快速地进行(每秒多达数千个细胞和/或液滴)。此外，该系统还提供了大规模(微微升或纳升容积的样品和试剂)细胞培养实验，其中生物样品被限制在液滴中，从而可以快速检测高浓度的化合物(从pM到μM范围)。此外，该系统最大程度地减少了样品损失和交叉污染，却可以实现快速混合、热传递和化学反应。有趣的是，该技术提供了在单个细胞水平上进行大规模基因型和表型筛选的可能性。在过去的几年中，已经提出了用于单细胞分析的不同微流体装置和系统(Gross等人2015，Int.J.Mol.Sci.16(8)：16897-16919；Reece等人2016，Curr.Opin.Biotechnol.40：90-96)。已经提出了用于微流控中的细胞分选的不同方法和技术。分选原理主要分为两类：基于细胞的物理特性(例如大小、可变形性、电学特性或光学特性)的方法，以及基于生物分子特性(尤其是特定表面抗原)的方法。使用与细胞成分结合的单克隆抗体可以实现高纯度的细胞分离和分选。广泛使用的基于抗体的细胞分析和/或分离技术包括细胞淘选、磁性细胞分选(MACS)和荧光活化的细胞分选(FACS)，包括荧光活化的液滴分选(FADS)。在细胞淘选技术中，表现出特定抗原的细胞可以选择性地附着在抗体包被的表面上。尽管该技术可以提供高纯度，但仍受某些限制(例如高细胞损失或对细胞存活的影响)的影响。在通过流式细胞术进行单细胞分选的其他细胞淘选技术中，可以通过结合至细胞表面或细胞外基质(如抗体包被的表面)的抗体选择性捕获分泌特定分子的细胞(Campbell等，2010J.Immunol.185：28-32；Manz等，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92：1921-1925)。尽管此技术可以检测分泌的分子，但在单个细胞水平上，当与流式细胞仪联接时，它会受到某些限制的影响，例如由于细胞浓度的高背景(从而影响细胞纯度)以及缺乏基于分泌的定量分离和缺乏实时定量分泌率测量。MACS使用结合抗体的磁珠在细胞表面捕获特异性抗原。可以在永久磁铁产生的磁场下有选择地收集标记有磁珠的细胞群。与FACS相比，MACS允许显著更高的产量，但不能进行单细胞分选并且纯度较低。另一个显著的限制是分离后难以分离和除去所述珠，这可能会阻碍后续分析。细胞分离的另一个示例是使用微流体方法，该方法基于用作珠线的磁珠颗粒的使用。该方法在国际专利申请WO2016/059182A1中公开，其中每个液滴的特征在于形成存在一列磁珠的颗粒聚集体，这些磁珠旨在通过捕获珠线上的所述分子并检测所述珠线上的元素的系统，来检测分泌分子的存在。WO2016/059182A1中提出的方法的优点是能够在单细胞水平上评估分泌的分子。然而，WO2016/059182A1中公开的方法取决于颗粒聚集体的存在，因此阻碍了在同一隔室内需要多个细胞的复杂测定。该测定法具有固有的灵活性限制。另外，敏感性本质上受到颗粒聚集体的结合能力的限制。通常，影响目前可用的基于分泌分子的分析和/或分离单个细胞的方法的局限性包括就每秒分离的单个细胞而言的效率低或产率/回收率低、分离过程中细胞活性/功能性下降、可靠性差、柔韧性差和/或产量低。因此，显而易见的是，强烈需要用于分析和分离化合物分泌单细胞的改进的微流体方法来解决上述问题。
技术实现思路
本专利技术的第一方面涉及一种在微流体系统中检测目标化合物的方法，该方法包括以下步骤：a.在所述微流体系统中产生至少一个液滴，所述至少一个液滴包括：i.至少一个单细胞，ii.一种或多种第一捕获剂，其中所述一种或多种第一捕获剂能够结合所述单细胞以及所述目标化合物，iii.包含标记的一种或多种第二捕获剂，其中所述一种或多种第二捕获剂能够结合所述目标化合物，b.培养能够产生可检测事件的所述至少一个液滴，c.对所述至少一个液滴进行直接检测，其中，所述可检测事件在所述至少一个液滴中的存在或重新定位确定所述目标化合物的存在。本专利技术的第二方面涉及根据第一方面的方法在监测生物事件中的用途。本专利技术的第三方面涉及一种用于检测液滴中的目标化合物的方法，该方法包括以下步骤：a.提供一种微流体系统，其包括：i.至少一个入口，ii.至少一个出口，iii.一个或多个通道，b.在所述微流体系统中注入液滴流，其中至少一个液滴包括：i.至少一个单细胞ii.能够结合所述单细胞以及所述目标化合物的多个第一捕获剂，和iii.多个第二捕获剂，每个第二捕获剂包含标记，其中所述多个第二捕获剂能够结合所述目标化合物，c.在允许产生目标化合物的条件下培养所述多个液滴，从而如果目标化合物是由单细胞产生的，所述目标化合物将被所述多个第一捕获剂和所述多个第二捕获剂捕获，d.通过检测所述标记的存在或重新定位来确定目标化合物的存在。本专利技术的第四方面涉及一种微流体系统，其包括：a.至少一个入口，...

【技术保护点】
1.一种在微流体系统中检测目标化合物的方法，该方法包括以下步骤：/na.在所述微流体系统中产生至少一个液滴，所述至少一个液滴包括：/ni.至少一个单细胞，/nii.一种或多种第一捕获剂，其中所述一种或多种第一捕获剂能够结合所述单细胞以及所述目标化合物，/niii.包含标记的一种或多种第二捕获剂，其中所述一种或多种第二捕获剂能够结合所述目标化合物，/nb.培养能够产生可检测事件的所述至少一个液滴，/nc.对所述至少一个液滴进行直接检测，/n其中，所述可检测事件在所述至少一个液滴中的存在或重新定位确定所述目标化合物的存在。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180418 EP 18168084.41.一种在微流体系统中检测目标化合物的方法，该方法包括以下步骤：
a.在所述微流体系统中产生至少一个液滴，所述至少一个液滴包括：
i.至少一个单细胞，
ii.一种或多种第一捕获剂，其中所述一种或多种第一捕获剂能够结合所述单细胞以及所述目标化合物，
iii.包含标记的一种或多种第二捕获剂，其中所述一种或多种第二捕获剂能够结合所述目标化合物，
b.培养能够产生可检测事件的所述至少一个液滴，
c.对所述至少一个液滴进行直接检测，
其中，所述可检测事件在所述至少一个液滴中的存在或重新定位确定所述目标化合物的存在。


2.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种第一捕获剂在产生至少一个单个液滴之前或之后结合所述至少一个单细胞的表面。


3.根据权利要求1和2中任一项所述的方法，其中所述一种或多种第一捕获剂以101至108分子/细胞的密度结合所述单细胞。


4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，在所述液滴中以10pM至100μM的浓度产生所述目标化合物。


5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述液滴的体积为2pL至10nL。


6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括在培养后测量液滴中的细胞存活的步骤。


7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述标记选自荧光标记、基于氨基酸的标记或基于核酸的标记或条形码标记。


8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述第一捕获剂和所述第二捕获剂独立地选自蛋白质、肽、寡核苷酸、核酸、荧光缀合物、酶共轭物、合成聚合物或其组合。


9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述第一捕获剂是抗体，而所述第二捕获剂是目标抗体的荧光抗化合物。


10.根据权利要求9的所述方法，其中所述第一捕获剂是双功能抗体。


11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中，所述目标化合物是细胞分泌的化合物，其选自但不限于抗体(IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgE、IgA(IgA1、IgA2)、IgM、细胞因子(IL-1样、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6样、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10-样、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-20、共同b链(CD131)、LIF、OSM、干扰素(IFN-α、IFN-β、IFN-γ)、TNF、TNF-α、TNF-β、CD153、CD154、LT-β、4-1BBL、APRIL、CD70、CD132、CD178、GITRL、LIGHT、OX40L、TALL-1、TRAIL、TWEAK、TRANCE、TGF-β、Tpo、Flt-3L、SCF、M-CSF、MSP)、趋化因子(CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9/CCL10、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCL17、X1L1、XCL2、CX3CL1)、激素(雌激素、孕激素、甲状腺素、类固醇、胰岛素、肾上腺素肾上腺素、褪黑素、三碘甲腺嘌呤、甲状腺素、前列腺素、白三烯、前列环素、Therocis、脂联素、促肾上腺皮质激素(或促肾上腺皮质激素)、糊精(或胰...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·P·V·杰勒德，V·门拉思，
申请(专利权)人：高保真生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：法国;FR