液滴单细胞表观基因组谱分析用于患者分层的用途制造技术

本发明专利技术的一个方面涉及一种用于抗药性的诊断和/或预后的方法，其中通过使用微流体系统对从受试者获得的细胞中的单细胞染色质状态进行谱分析。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】液滴单细胞表观基因组谱分析用于患者分层的用途
本专利技术属于分子生物学、抗药性和微流体领域。特别地，本专利技术涉及一种测定微流体液滴中的核酸以用于抗药性的诊断和/或预后和患者分层的方法。
技术介绍
真核生物基因组被组织化成染色质，其使得能够不仅压缩DNA，而且还调节DNA代谢(复制、转录、修复、重组)。因此，当前的挑战是理解(i)功能性染色质结构域是如何在细胞核中建立的，(ii)染色质结构/信息是如何通过组装、拆卸、修饰和重塑机制而动态化的，和(iii)这些事件是如何在疾病建立以及疾病的进展和复发中参与/维持的。理解这些事件将允许确定疾病进展的新机制和新的治疗靶标，以及治疗性分子的控制作用。此外，生物学中的基本研究问题是了解数百种不同的细胞类型是如何从多细胞生物中的相同遗传物质产生的。许多不同细胞类型不能仅通过遗传学来解释，而是通过可以将表型与基因型联系起来的额外信息来解释。1942年，康拉德·H·沃丁顿(ConradH.Waddington)创造了表观遗传学一词以指“研究基因及其产物之间因果相互作用的生物学分支，其使表型形成”。“表观遗传信息”的这一额外层次储存为构成染色质的DNA和组蛋白两者的化学修饰的形式。表观遗传机制通过染色质修饰来调节基因表达和塑造特定的染色质景观(landscape)，其允许进行对细胞类型和组织身份的预测。DNA和组蛋白修饰通过充当能够读取信息的效应蛋白的识别位点和通过稳定其与染色质的结合来参与到各种基于DNA的过程之中。高丰度的组蛋白修饰使得能够严格控制染色质结构且在对基于DNA的过程的调节中具有极大灵活性。这种多样性导致了可在不同位点处同时修饰的组蛋白之间的串扰(Wang等，2008，NatureGenetics40(7)：897-903)。组蛋白修饰可以正面地或负面地影响彼此。此外，组蛋白修饰之间的交流也与其他染色质修饰(例如DNA甲基化)一同存在，其均参与微调生物学功能的整体调控(Du等，2015，NatureReviewsMolecularCellBiology，16(9)：519-532)。DNA和组蛋白修饰有助于定义在不同染色质状态内的表观基因组特征，所述表观基因组特征对细胞类型和组织身份具有高指示性。可以利用对这些标记的全基因组谱分析来了解基因组调控的全局景观，然后例如区分正常细胞和疾病细胞状态的背景下的表观基因组差异(ConsortiumEpigenomics2015，Nature518(7539)：317-329)。然而，染色质谱分析技术的当前状态不允许研究细胞异质性，也不允许检测染色质状态中的细胞间差异。使用传统的ChIP-seq方法对表观遗传修饰、表观遗传标记物/擦除物(eraser)、在染色质结构中起作用的因子、2D和3D组织化的全基因组作图需要大量细胞以生成高质量的结合位点谱分析。多项研究已显示优化的ChIP-seq方案将输入材料从数百万个细胞减少至数百个细胞，而不丢失在对富集或耗竭区域的检测中的分辨率(Adli等，2010，NatureMethods7(8)：615-618；Brind’Amour等，2015，NatureCommunications6：6033；Ma等，2018，ScienceAdvances4(4)：eaar8187)。然而，这些方法仅产生修饰状态的平均快照，而无法提供对表观遗传异质性的见解。在单细胞分辨率下对组蛋白修饰进行谱分析仍然具有挑战性，部分是因为免疫沉淀过程中与非特异性结合相关联的噪声水平倾向于随低量起始原料增加。从一个单一细胞免疫沉淀染色质在技术上是可行的，但会导致高度可变的结果。可以预先用特定且独特的DNA序列(条形码)将来自分离的单细胞的染色质索引化，然后与来自数个至数千个细胞的索引化染色质结合，以成批地进行免疫沉淀，如传统ChIP-seq方案中。这种方法在保留单细胞信息的同时，规避了与低输入材料的免疫沉淀中的高实验噪声相关的问题。的确是，对于一个细胞特有的条形码，每个读数(read)可在测序后归属于其原始细胞。然而，就像其他涉及分子索引化的单细胞技术一样，只有索引化核小体具有被扩增和测序的可能性。在这方面，Rotem开发了Drop-ChIP技术，该技术将染色质索引化方法与基于液滴的微流体技术相结合以对数千个细胞的组蛋白修饰进行谱分析(Rotem等，2015，NatureBiotechnol.33(11)：1165-1172)。该液滴形式为进行单细胞分析提供了一种多功能的工具。在通过液滴中的细胞的微球菌核酸酶进行区室化(compartmentalization)、裂解和染色质片段化的步骤之后，然后将所述液滴与包含DNA条形码的第二群体的液滴一对一融合，允许在单细胞水平上对染色质进行索引化。尽管使用Drop-ChIP揭示了在胚胎干细胞的群体中的不同染色质状态，但由于低染色质索引化效率或索引化核小体的不良回收，单细胞信息仅限于每细胞检测到的少至数百个独特的富集化基因座。值得注意的是，Drop-ChIP技术受到两个主要限制，其可负面地影响每细胞回收的信息量。首先，只有对称索引化的核小体才可以被扩增并可以成为测序文库的一部分。这个要求极大地增加了系统的严格性，并对核小体(即仅两端均连接至条形码的那些)施加了强力的选择。其次，索引化核小体的扩增仅依赖于聚合酶链反应(PCR)的众多循环，其增加了引入扩增偏倚和错误的可能性。未经处理的细胞中的染色质状态的自发异质性可以是获得抗药性的关键分子组成部分，不管癌症治疗的作用机制是什么。许多类型的癌症最初易受化学治疗药物的影响，随时间可通过这些和其他机制产生抗药性。然而，抗药性的方法可能是疾病特异性的，而其他方法可以是进化保守的。化学疗法和靶向疗法的抗性的出现是癌症治疗的主要挑战。在未经治疗的肿瘤内的遗传异质性现被认为是抗药性的关键决定因素。此外，预计非遗传且特别是转录和表观遗传机制在面对环境、代谢或治疗相关压力的癌细胞的适应中发挥作用(Rathert，P.等，Nature525，543-547，(2015)；Kim，C.等，Cell173，879-893e813，(2018))。通过组蛋白修饰调节染色质结构是主要的表观遗传机制和基因表达的调节因素，然而，染色质特征对肿瘤异质性和进化的贡献仍然是未知的。考虑到影响本领域已知方法的上述局限，显然需要用于与不同染色质状态相关的抗药性的诊断和/或预后的改进的方法和组合物，其在微流体液滴中使用单细胞表观遗传谱分析。本专利技术的某些实施方式公开了在未经治疗的、药物敏感的肿瘤中的罕见细胞群体显示出与抗性细胞的染色质特征相匹配的染色质特征。本专利技术人已经开发了液滴微流体方法以在单细胞分辨率下以高达10,000个基因座/细胞的覆盖率对数千个细胞的染色质景观进行谱分析，该方法具有如本文所公开的多种应用。
技术实现思路
本专利技术的一个方面涉及一种用于抗药性的诊断和/或预后的组合物和方法，其中通过使用微流体系统对从受试者获得的细胞中的单细胞染色质状态进行谱分析，所述方法包括以下步骤：a.提供至少第一类型本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于抗药性的诊断和/或预后的方法，其中通过使用微流体系统对从受试者获得的细胞中的单细胞染色质状态进行谱分析，所述方法包括以下步骤：/na.提供至少第一类型的液滴，其中所述第一类型的液滴包含/ni.生物要素，/nii.裂解缓冲液，和/niii.核酸酶，/nb.在暂时使所述核酸酶失活的条件下收集所述第一类型的液滴，/nc.孵育所述第一类型的液滴，从而重新激活所述核酸酶，/nd.提供至少第二类型的液滴，其中所述第二类型的液滴包含核酸序列，/ne.融合所述第一类型的液滴和所述第二类型的液滴，从而生成第三类型的液滴，/nf.孵育所述第三类型的液滴，从而将所述核酸序列连接至一个或多个感兴趣的基因组区域，/ng.对所述一个或多个感兴趣的基因组区域进行测序。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180713 EP 18183542.2;20190424 EP 19000200.61.一种用于抗药性的诊断和/或预后的方法，其中通过使用微流体系统对从受试者获得的细胞中的单细胞染色质状态进行谱分析，所述方法包括以下步骤：
a.提供至少第一类型的液滴，其中所述第一类型的液滴包含
i.生物要素，
ii.裂解缓冲液，和
iii.核酸酶，
b.在暂时使所述核酸酶失活的条件下收集所述第一类型的液滴，
c.孵育所述第一类型的液滴，从而重新激活所述核酸酶，
d.提供至少第二类型的液滴，其中所述第二类型的液滴包含核酸序列，
e.融合所述第一类型的液滴和所述第二类型的液滴，从而生成第三类型的液滴，
f.孵育所述第三类型的液滴，从而将所述核酸序列连接至一个或多个感兴趣的基因组区域，
g.对所述一个或多个感兴趣的基因组区域进行测序。


2.根据权利要求1所述的方法，其中所述一个或多个感兴趣的基因组区域是修饰的基因组区域。


3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述修饰的基因组区域包含核酸序列和/或与核酸序列相关联的蛋白质复合物。


4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述修饰...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·P·V·杰勒德，K·A·格罗瑟兰，A·D·格里菲斯，C·V·D·M·瓦洛特，
申请(专利权)人：高保真生物技术有限公司，居里研究所，普斯尔公司，国家科学研究中心，索邦大学，巴黎高等理工化工学校，
类型：发明
国别省市：法国;FR