肝类器官疾病模型以及其制备和使用方法技术

本文公开了制备和使用脂毒性类器官模型的方法。在某些方面，所述方法可以包括使肝类器官与游离脂肪酸(FFA)组合物接触的步骤。一方面，所述FFA组合物可以包括油酸、亚油酸、棕榈酸或其组合。

Model of liver diseases and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】肝类器官疾病模型以及其制备和使用方法相关申请的交叉引用本申请要求于2016年11月4日提交的美国临时专利申请62/471,371和2016年6月9日提交的美国临时专利申请62/517,414的优先权和权益，所述每个申请的内容通过引用以其整体并入用于所有目的。
技术介绍
不可逆的上皮器官重塑是导致全球死亡和疾病的主要因素，每年使医疗保健系统损失数十亿美元(Hynds和Giangreco，2013)。上皮重塑疾病包含肺癌和胃肠癌以及慢性疾病，如肝硬化、慢性阻塞性肺病(COPD)和炎性肠病(Hynds和Giangreco，2013)。可悲的是，主要针对动物进行的大多数上皮器官研究未能为这些疾病产生新疗法，并且死亡率仍然高得令人无法接受。部分原因是由于缺乏预测性人体系统以测试制药行业中大量增加的化合物库的功效，因此对开发用于模拟人类炎症和纤维化以实现临床相关治疗开发的高保真系统提出了根本性挑战。非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是发达国家需要克服的主要挑战之一，因为发生致死性肝病的可能性增加，但缺乏有效的治疗方法。同样，医源性肠胃外营养相关肝病(PNALD)是一种由肠胃外营养引起的病症，并且目前尚无有效的治疗方法。需要具有脂肪性肝炎和/或肝病的临床组织病理学特征，如脂滴积聚和膀胱骨架细丝解体、脂肪变性和肝细胞气球样变，并且可以用于解决这些和其它肝病症或疾病状态的模型。尽管使用患者干细胞的疾病模型有希望，但目前的方法在其应用中仅限于单细胞、单基因和相对简单的病理，未能捕获更普遍和复杂的疾病病理学，如上皮器官纤维化。人体肝是一种重要的器官，为生命提供许多重要的代谢功能，如脂质代谢、铵和胆汁的产生、凝血以及外源性化合物的解毒作用。使用诱导多能干细胞(iPSC)技术，由于许多有希望的应用，包含再生疗法、药物发现和药物毒性研究，体外重建患者的肝反应对制药工业具有吸引力。为此目的，目前，常规的体外方法研究二维(2-D)和3-D分化平台以生成肝细胞。然而，大多数报道的方法主要将细胞分化成靶上皮细胞类型，完全缺乏必需的支持组分，如促纤维化和/或炎性细胞类型。替代性地，申请人和其他人已经提出通过混合上皮和支持谱系的基于共培养的方法，然而，这些测定变化很大并且经常被许多人为变化混淆，如难以选择上皮细胞培养基(ECM)和可以共同维护的培养基。因此，需要建立新的和稳健的测定系统，其中支持谱系共同开发用于疾病建模和进一步的筛选应用。
技术实现思路
本文公开了制备和使用脂毒性类器官模型的方法。在某些方面，所述方法可以包括使肝类器官与游离脂肪酸(FFA)组合物接触的步骤。在一方面，所述FFA组合物可以包括油酸、亚油酸、棕榈酸或其组合。附图说明本领域中的技术人员将理解，下面描述的附图仅用于说明性目的。附图不旨在以任何方式限制本教导的范围。专利或申请文件包含至少一幅彩色附图。具有一副或多副彩色附图的本专利或专利申请公开的副本将在请求并支付必要费用后由主管局提供。图1.人iPSC-肝类器官中纤维化前和炎症谱系的共分化A.基于视黄酸(RA)的肝类器官分化方法和第20天肝类器官的明视野图像的示意图。比例尺，100μm。B.在存在和不存在4天RA的培养之后第20天基质胶中肝类器官的明视野图像。C.在存在(黑色条)和不存在(灰色条)4天RA的培养之后第20天手动测量类器官数。D.在存在(黑色条)和不存在(灰色条)4天RA的培养之后第20天，通过图像J识别和测量类器官的直径。E.白蛋白产生是从培养之后24小时收集的培养物上清液测量的，所述培养是在第22天到第25天培养之后，在基质胶中用(黑色条)或不用(灰色条)4天RA的肝类器官。F.在存在和不存在4天RA下培养之后第25天手动计数具有内腔结构的类器官。红色和灰色条分别表示具有(HLO)/不具有(球状体)内腔结构的类器官的百分比。G.通过二乙酸荧光素(FD)监测胆汁转运活性，其在肝细胞中的酯酶水解之后，在培养基中变成荧光素(绿色)并跟踪荧光的流动。结果代表平均值±sd，n＝3。通过流式细胞术确定Epcam、CD166和CD68阳性群体的百分比。结果代表平均值±sd，n＝2-3。H.单细胞RNA测序！！由人iPSC、人iPSC衍生的定形内胚层、前肠球状体、HLO、人成体肝组织和人胎肝组织表达的肝细胞、星状细胞、库普弗细胞和内皮相关基因的FPKM(log2)值。I.通过流式细胞术确定Epcam、CD166、CD68和F4/80阳性群体的百分比。结果代表平均值±sd，n＝3。J.第25天HLO对白蛋白、CD68、波形蛋白、GFAP和Epcam的免疫荧光(IF)染色。白色箭头表示CD68、GFAP和波形蛋白阳性细胞的定位。结果代表平均值±sd，n＝3。K.通过使用反映吞噬作用的pHrodo指示剂(红色)监测细胞内pH来分析吞噬细胞活性。在共聚焦显微镜下捕获荧光表达。结果代表平均值±sd，n＝6。图2.通过脂肪酸处理生成脂肪性肝炎类器官(sHLO)A.表示生成脂肪性肝炎HLO(sHLO)的方法的示意图B.脂滴(绿色)、膜(红色)和核(蓝色)的活细胞成像。图像是从10个到20个Z-堆叠图像的叠加采用的。以剂量依赖的方式观察到脂滴积聚的增加和脂滴和细胞的增大。C.由每个类器官大小标准化的代表性总脂质体积。条形图示出总脂质体积的平均值。脂滴以剂量依赖性方式增加0(黑色)、200μMOa(红色)、400μMOa(绿色)和800μMOA(蓝色)。D.HLO中甘油三酯的定量。从一个基质胶滴分离HLO，并在油酸(800μM)存在(蓝色条)或不存在(黑色条)下分成HCM培养基并培养3天。E.用从含有20个到30个HLO的孔获得的培养物上清液对IL-6进行ELISA测量，所述孔在油酸(800μM)存在或不存在下培养并培养3天。最终值通过每个孔中的类器官数量标准化。当与非处理(黑色条)相比时，IL-6在800μMOA处理(蓝色条)中释放2.2倍。F.促炎细胞因子TNF-α和IL-8的基因表达。它们被18S标准化。与未处理(黑色条)相比，在200μMOa(红色条)和800μMOA(蓝色条)中TNF-α和IL-8基因表达两者均上调。G.将10个到20个HLO在包含0uM、400uM、800uMOA的HCM培养基中培养3天。从每个孔收集培养的上清液，并通过使用跨膜与那些上清液测量THP-1迁移。对已经迁移的细胞进行计数，并通过每个孔中确切的类器官数量进行标准化。H.HLO(黑色条)、sHLO(红色条)和cHLO(蓝色条)群体上的第25天HLO的三色染色和三色染色的HLO的百分比。结果代表平均值±sd，n＝8个到20个类器官。I.对于Epcam和波形蛋白的第25天HLO的IF染色和HLO(黑色条)、sHLO(红色条)和cHLO(蓝色条)群体上的Epcam和波形蛋白阳性HLO的百分比。结果代表平均值±sd，n＝8个到20个类器官。J.在存在或不存在油酸(800μM)下培养20个到30个HLO5天。用那些上清液通过ELISA测量P3NP。最终值通过每个孔中的类器官确切数量标准化。当与未处理(黑色条)相比时，P3NP在800μMOA处理(蓝色条)中增加2.8倍。图3.由AFM测量脂肪性肝炎HLO的肝硬化转变。A.用AFM测量HLO硬度的示意图。用本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备脂毒性类器官模型的方法，其包括使肝类器官与游离脂肪酸(FFA)组合物接触的步骤，其中所述FFA组合物包括油酸、亚油酸、棕榈酸或其组合，优选地油酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.11.04 US 62/417,371;2017.06.09 US 62/517,4141.一种制备脂毒性类器官模型的方法，其包括使肝类器官与游离脂肪酸(FFA)组合物接触的步骤，其中所述FFA组合物包括油酸、亚油酸、棕榈酸或其组合，优选地油酸。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述脂毒性类器官模型是脂肪肝病的模型。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述脂毒性类器官模型是脂肪性肝炎的模型。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述脂毒性类器官模型是肝硬化的模型。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述脂毒性类器官模型是肠胃外营养相关肝病(PNALD)的模型。6.根据权利要求1所述的方法，其中所述脂毒性类器官模型是NAFLD的模型。7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述脂毒性类器官模型的特征在于细胞骨...

【专利技术属性】
技术研发人员：武部贵则，R·奥奇，木村昌树，
申请(专利权)人：儿童医院医学中心，国立研究开发法人科学技术振兴机构，
类型：发明
国别省市：美国,US