用于制备类器官组合物的改进方法技术

本文公开了通过使肠内胚层单层聚集和培养所得肠内胚层聚集体的过程产生的类器官或其组合物。这些聚集的类器官的实例包含但不限于聚集的肝脏类器官、聚集的胃类器官、聚集的肠类器官和聚集的结肠类器官。肠类器官和聚集的结肠类器官。肠类器官和聚集的结肠类器官。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于制备类器官组合物的改进方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2019年8月13日提交的美国临时专利申请第62/885,903号的优先权的权益，所述美国临时专利申请特此通过引用整体明确并入本文。


[0003]本公开的各方面总体上涉及类器官组合物和其制备方法，涉及前体细胞的聚集，例如在形成板中。

技术介绍

[0004]人多能干细胞(hPSC；包含胚胎干细胞和诱导多能干细胞两者)表示用于生成人类3维胃肠组织(例如人肠类器官；HIO)的可再生资源，所述胃肠组织被组织成离散的上皮和间充质层。例如，在HIO中，上皮含有所有已知的肠上皮细胞类型，并且表现出功能性肠组织的若干种性质，包含吸收、肠激素合成和粘液分泌。在移植到实验动物模型之后，HIO经历了显著的生长和成熟，类似于含有粘膜、粘膜下层和固有肌层的出生后人类肠道。上皮细胞布置成隐窝
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绒毛结构，在隐窝和成熟的上皮细胞中含有成体干细胞活性/祖区，具有如营养吸收和刷状缘酶活性等功能。因此，源自多能干细胞的类器官表示用于研究肠发育和疾病的生理相关且强大的工具，并且也为药物开发提供了新的平台。此外，鉴于诱导多能干细胞可以源自任何个体，包含那些患有肠疾病的个体，因此有可能产生疾病/患者特异性类器官，如用于个性化医疗应用的HIO。持续需要更接近体内组织的改进的类器官组合物以及制备更稳健、可扩展、更快和成本效益更高的类器官组合物的方法。

技术实现思路

[0005]本文公开了产生一个或多个聚集的类器官的方法。在一些实施例中，所述方法包括：将定形内胚层分化为肠内胚层单层和肠球状体；将所述肠内胚层单层与所述肠球状体分离；将所述肠内胚层单层解离成肠内胚层细胞的单细胞悬浮液；将所述肠内胚层细胞的单细胞悬浮液聚集成一个或多个肠内胚层聚集体；以及培养所述一个或多个肠内胚层聚集体以产生所述一个或多个聚集的类器官。在一些实施例中，所述肠内胚层单层是粘附的，并且所述肠球状体被分离并悬浮在生长培养基中。在一些实施例中，所述定形内胚层已经从多能干细胞分化而来。在一些实施例中，所述定形内胚层已经从胚胎干细胞或诱导多能干细胞分化而来。在一些实施例中，所述定形内胚层是人定形内胚层。在一些实施例中，所述分离步骤包括从所述肠内胚层单层中抽吸所述生长培养基和悬浮的肠球状体。在一些实施例中，所述解离步骤包括使所述肠内胚层单层酶促解离。在一些实施例中，所述肠内胚层单层是用Accutase、Accumax、胰蛋白酶、胰蛋白酶/EDTA、胶原酶、分散酶、TrypLE Express或TrypLE Select或其任何组合酶促解离的。在一些实施例中，所述聚集步骤包括在悬滴中聚集所述单细胞悬浮液，在“v”或“u”底微孔培养板中使所述单细胞悬浮液离心，使用定轨振荡器聚集所述单细胞悬浮液，或在形成板中使所述单细胞悬浮液离心，或其任何组合。在一
些实施例中，所述形成板是Aggrewell板。在一些实施例中，所述一个或多个肠内胚层聚集体中的每个肠内胚层聚集体包括约250、约500、约1000、约1500、约2000、约2500、约3000、约3500、约4000、约4500、约5000、约5500、约6000、约6500、约7000、约7500、约8000、约8500、约9000、约9500或约10000个肠内胚层细胞，或在由上述细胞数量中的任何两个所限定的范围内的任何数量的肠内胚层细胞。在一些实施例中，所述培养步骤包括使所述一个或多个肠内胚层聚集体与胞外基质或其模拟物或衍生物接触。在一些实施例中，所述胞外基质或其模拟物或衍生物包括基质胶(Matrigel)。
[0006]在本文公开的实施例中的任何实施例中，所述肠内胚层单层是前肠内胚层单层并且所述肠球状体是前肠球状体。在一些实施例中，将所述定形内胚层分化为所述前肠内胚层单层和所述前肠球状体包括使所述定形内胚层与一种或多种FGF信号传导通路激活剂、一种或多种Wnt信号传导通路激活剂或一种或多种BMP信号传导通路抑制剂或其任何组合接触。在一些实施例中，所述一种或多种FGF信号传导通路激活剂包括FGF4，所述一种或多种Wnt信号传导通路激活剂包括CHIR99021，或者所述一种或多种BMP信号传导通路抑制剂包括头蛋白(Noggin)，或其任何组合。在一些实施例中，所述一个或多个聚集的类器官是聚集的肝脏类器官。在一些实施例中，培养所述一个或多个肠内胚层聚集体以形成所述一个或多个聚集的肝脏类器官包括使所述一个或多个肠内胚层聚集体与一种或多种FGF信号传导通路激活剂、一种或多种BMP信号传导通路激活剂、视黄酸、肝细胞生长因子、地塞米松或制瘤素M或其任何组合接触。在一些实施例中，所述一种或多种FGF信号传导通路激活剂包括FGF2，或所述一种或多种BMP信号传导通路激活剂包括BMP4，或两者。在一些实施例中，所述一个或多个聚集的类器官是聚集的胃类器官。在一些实施例中，所述一个或多个聚集的类器官是聚集的胃类器官。在一些实施例中，所述一个或多个聚集的胃类器官是聚集的胃窦类器官。在一些实施例中，培养所述一个或多个肠内胚层聚集体以形成所述一个或多个聚集的胃窦类器官包括使所述一个或多个肠内胚层聚集体与EGF、视黄酸或一种或多种BMP信号传导通路抑制剂或其任何组合接触。在一些实施例中，所述一种或多种BMP信号传导通路抑制剂包括头蛋白。
[0007]在本文公开的实施例中的任何实施例中，所述肠内胚层单层是后肠内胚层单层并且所述肠球状体是后肠球状体。在一些实施例中，将所述定形内胚层分化为所述后肠内胚层单层和所述后肠球状体包括使所述定形内胚层与一种或多种FGF信号传导通路激活剂、或一种或多种Wnt信号传导通路激活剂或两者接触。在一些实施例中，所述一种或多种FGF信号传导通路激活剂包括FGF4，或所述一种或多种Wnt信号传导通路激活剂包括CHIR99021，或两者。在一些实施例中，所述一个或多个聚集的类器官是聚集的肠类器官。在一些实施例中，培养所述一个或多个肠内胚层聚集体以形成所述一个或多个聚集的肠类器官包括使所述一个或多个肠内胚层聚集体与EGF、一种或多种Wnt信号传导通路激活剂或一种或多种BMP信号传导通路抑制剂或其任何组合接触。在一些实施例中，所述一种或多种Wnt信号传导通路激活剂包括R
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脊椎蛋白，或所述一种或多种BMP信号传导通路抑制剂包括头蛋白，或两者。在一些实施例中，所述一个或多个聚集的类器官是聚集的结肠类器官。在一些实施例中，培养所述一个或多个肠内胚层聚集体以形成所述一个或多个聚集的结肠类器官包括使所述一个或多个肠内胚层聚集体与EGF、一种或多种Wnt信号传导通路激活剂或一种或多种BMP信号传导通路激活剂或其任何组合接触。在一些实施例中，所述一种或多种
Wnt信号传导通路激活剂包括R
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脊椎蛋白，或所述一种或多种BMP信号传导通路激活剂包括BMP2，或其任何组合。
[0008]在本文公开的实施例中的任何实施例中，所述一个或多个肠内胚层聚集体包括至少1、10、100、200、300、400、500本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种产生一个或多个聚集的类器官的方法，所述方法包括：将定形内胚层分化为肠内胚层单层和肠球状体，其中所述肠内胚层单层是粘附的，并且所述肠球状体被分离并悬浮在生长培养基中；将所述肠内胚层单层与所述肠球状体分离；将所述肠内胚层单层解离成肠内胚层细胞的单细胞悬浮液；将所述肠内胚层细胞的所述单细胞悬浮液聚集成一个或多个肠内胚层聚集体；以及培养所述一个或多个肠内胚层聚集体以产生所述一个或多个聚集的类器官。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述定形内胚层已经从多能干细胞分化而来。3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述定形内胚层已经从胚胎干细胞或诱导多能干细胞分化而来。4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述定形内胚层是人定形内胚层。5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述分离步骤包括从所述肠内胚层单层中抽吸所述生长培养基和悬浮的肠球状体。6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述解离步骤包括使所述肠内胚层单层酶促解离。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述肠内胚层单层是用Accutase、Accumax、胰蛋白酶、胰蛋白酶/EDTA、胶原酶、分散酶、TrypLE Express或TrypLE Select或其任何组合酶促解离的。8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述聚集步骤包括在悬滴中聚集所述单细胞悬浮液，在“v”或“u”底微孔培养板中使所述单细胞悬浮液离心，使用定轨振荡器聚集所述单细胞悬浮液，或在形成板中使所述单细胞悬浮液离心，或其任何组合。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述形成板是Aggrewell板。10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一个或多个肠内胚层聚集体中的每个肠内胚层聚集体包括约250个、约500个、约1000个、约1500个、约2000个、约2500个、约3000个、约3500个、约4000个、约4500个、约5000个、约5500个、约6000个、约6500个、约7000个、约7500个、约8000个、约8500个、约9000个、约9500个或约10000个肠内胚层细胞，或在由上述细胞数量中的任何两个限定的范围内的任何数量的肠内胚层细胞。11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述培养步骤包括使所述一个或多个肠内胚层聚集体与胞外基质或其模拟物或衍生物接触。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述胞外基质或其模拟物或衍生物包括基质胶(Matrigel)。13.根据权利要求1到12中任一项所述的方法，其中所述肠内胚层单层是前肠内胚层单层，并且所述肠球状体是前肠球状体。14.根据权利要求13所述的方法，其中将所述定形内胚层分化为所述前肠内胚层单层和所述前肠球状体包括使所述定形内胚层与一种或多种FGF信号传导通路激活剂、一种或多种Wnt信号传导通路激活剂或一种或多种BMP信号传导通路抑制剂或其任何组合接触。15.根据权利要求14所述的方法，其中所述一种或多种FGF信号传导通路激活剂包括FGF4，所述一种或多种Wnt信号传导通路激活剂包括CHIR99021，或者所述一种或多种BMP信号传导通路抑制剂包括头蛋白(Noggin)，或其任何组合。
16.根据权利要求13到15中任一项所述的方法，其中所述一个或多个聚集的类器官是聚集的肝脏类器官。17.根据权利要求16所述的方法，其中培养所述一个或多个肠内胚层聚集体以形成所述一个或多个聚集的肝脏类器官包括使所述一个或多个肠内胚层聚集体与一种或多种FGF信号传导通路激活剂、一种或多种BMP信号传导通路激活剂、视黄酸、肝细胞生长因子、地塞米松(dexamethasone)或制瘤素M(Oncostatin M)或其任何组合接触。18.根据权利要求17所述的方法，其中所述一种或多种FGF信号传导通路激活剂包括FGF2，或所述一种或多种BMP信号传导通路激活剂包括BMP4，或两者。19.根据权利要求13到15中任一项所述的方法，其中所述一个或多个聚集的类器官是聚集的胃类器官。20.根据权利要求19所述的方法，其中所述一个或多个聚集的胃类器官是聚集的胃窦类器官。21.根据权利要求20所述的方法，其中培养所述一个或多个肠内胚层聚集体以形成所述一个或多个聚集的胃窦类器官包括使所述一个或多个肠内胚层聚集体与EGF、视黄酸或一种或多种BMP信号传导通路抑制剂或其任何组合接触。22.根据权利要求21所述的方法，其中所述一种或多种BMP信号传导通路抑制剂包括头蛋白。23.根据权利要求1到12中任一项所述的方法，其中所述肠内胚层单层是后肠内胚层单层，并且所述肠球状体是后肠球状体。24.根据权利要求23所述的方法，其中将所述定形内胚层分化为所述后肠内胚层单层和所述后肠球状体包括使所述定形内胚层与一种或多种FGF信号传导通路激活剂、或一种或多种Wnt信号传导通路激活剂或两者接触。25.根据权利要求24所述的方法，其中所述一种或多种FGF信号传导通路激活剂包括FGF4，或所述一种或多种Wnt信号传导通路激活剂包括CHIR99021，或两者。26.根据权利要求23到25中任一项所述的方法，其中所述一个或多个聚集的类器官是聚集的肠类器官。27.根据权利要求26所述的方...

【专利技术属性】
技术研发人员：C，
申请(专利权)人：儿童医院医学中心，
类型：发明
国别省市：