产生和扩增造血干细胞的方法技术

在体外培养系统中生产和维持造血干细胞已被证明是难以达到的。本文公开了源自类器官如肝脏类器官的造血干细胞组合物。这些类器官还包含罕见类型的免疫细胞，由于难以从生物样品中分离所述免疫细胞，因此其尚未被完全阐明。本文还公开了从类器官产生所述造血干细胞和免疫细胞的方法，以及使用这些类器官从其他来源扩增造血干细胞的方法。来源扩增造血干细胞的方法。来源扩增造血干细胞的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】产生和扩增造血干细胞的方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2019年5月31日提交的美国临时专利申请号62/855,524和2019年5月31日提交的美国临时专利申请号62/855,536的优先权权益，在此将它们每一篇通过引用以其整体并入。
[0003]序列表参考
[0004]本申请与电子格式的序列表一起提交。序列表以名为CHMC63_019WOSeqListing.TXT的文件提供，该文件于2020年5月18日创建并最后修改，大小为2,077字节。电子序列表中的信息在此通过引用以其整体并入本文。
专利

[0005]本公开的方面一般地涉及造血干细胞组合物及其制备方法。

技术介绍

[0006]在临床上，源自骨髓的造血干细胞(HSC)移植是全球每年进行超过40,000次的常见手术。可进行这些移植以治疗各种类型的血癌、免疫疾病和血细胞基因缺陷。HSC移植可以自体(使用患者自己的细胞)或同种异体(使用人类白细胞抗原(HLA)匹配的供体)进行。然而，由于患者自身健康细胞的可用性有限，自体移植通常不是一种选择，同种异体移植可能导致可能是慢性的移植物抗宿主病(GVHD)，并且需要使患者面临感染风险的免疫抑制剂。因此，同种异体移植的存活率较低。
[0007]虽然可以收集来自脐带血(UCB)的HSC用于患者，但可以通过这种方式获得的细胞数量有限，并且目前还没有培养方法在体外显著扩增其数量。此外，之前从iPSC生产HSC的尝试需要引入具有未知风险的外源转基因，从而阻碍了潜在的临床应用。目前需要并且持久需要HSC的稳健生产和扩增，例如用于自体或同种异体移植中。

技术实现思路

[0008]本公开的一些方面涉及产生造血干细胞的肝脏类器官的生产方法。在一些实施方案中，所述方法包括在足以将前肠球状体(foregut spheroid)分化为肝脏类器官的条件下培养前肠球状体。在一些实施方案中，肝脏类器官包含分化成造血干细胞的CD34
+
成血内皮细胞群。在一些实施方案中，在足以将前肠球状体分化为肝脏类器官的条件下培养前肠球状体包括使前肠球状体与一种或多种(例如至少1、2、3种)FGF信号传导途径激活剂、Wnt信号传导途径激活剂或BMP抑制剂或者它们的任何组合接触。在一些实施方案中，在足以将前肠球状体分化为肝脏类器官的条件下培养前肠球状体包括使前肠球状体与FGF信号传导途径激活剂或Wnt信号传导途径激活剂或两者接触。在一些实施方案中，FGF信号传导途径激活剂是FGF4。在一些实施方案中，Wnt信号传导途径激活剂是CHIR99021。在一些实施方案中，BMP抑制剂是Noggin。在一些实施方案中，培养前肠球状体包括使前肠球状体与Notch激活剂或配体接触。在一些实施方案中，Notch激活剂或配体是、包含、基本上由、或由DLL1、
DLL3、DLL4、JAG1或JAG2的一种或多种或其任何组合组成。在一些实施方案中，Notch激活剂或配体是、包含、基本上由或由表达DLL1、DLL3、DLL4、JAG1或JAG2中的一种或多种或其任何组合的细胞组成。在一些实施方案中，前肠球状体包含表达一种或多种Notch激活剂或配体的细胞，Notch激活剂或配体选自DLL1、DLL3、DLL4、JAG1或JAG2或其任何组合。在一些实施方案中，培养前肠球状体包括使前肠球状体与IL
‑
3、IL
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34或GM
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CSF中的一种或多种或其任何组合接触。在一些实施方案中，培养前肠球状体包括使前肠球状体与干细胞因子(SCF)或血小板生成素(TPO)或两者接触。在一些实施方案中，培养前肠球状体不包括使前肠球状体与视黄酸(RA)接触。在一些实施方案中，培养前肠球状体不包括使前肠球状体与地塞米松、制瘤素M或肝细胞生长因子中的一种或多种或其任何组合接触。在一些实施方案中，造血干细胞不外源性表达ERG、HOXA5、HOXA9、HOXA10、LCOR、RUNX1、SPI1、FOSB或GFI1中的一种或多种或其任何组合。在一些实施方案中，该方法包括从肝脏类器官分离成血内皮细胞群或造血干细胞或两者。在一些实施方案中，分离成血内皮细胞群或造血干细胞或两者是通过从肝脏类器官中分选CD34+、CD45+或两者的细胞群进行的。在一些实施方案中，该方法包括在足以将诱导多能干细胞分化为定形内胚层的条件下培养诱导多能干细胞，并在足以将定形内胚层分化为前肠球状体的条件下培养定形内胚层，然后在足以将前肠球状体分化为肝脏类器官的条件下培养前肠球状体。在一些实施方案中，该方法包括在足以将定形内胚层分化为前肠球状体的条件下培养定形内胚层，然后在足以将前肠球状体分化为肝脏类器官的条件下培养前肠球状体。
[0009]本公开的一些方面涉及肝脏类器官。在一些实施方案中，肝脏类器官是通过本文公开的任何一种方法产生的肝脏类器官。
[0010]本公开的一些方面涉及成血内皮细胞群。在一些实施方案中，成血内皮细胞群通过本文公开的任何一种方法产生。
[0011]本公开的一些方面涉及造血干细胞。在一些实施方案中，造血干细胞通过本文公开的任何一种方法产生。
[0012]本公开的一些方面涉及用于从肝脏类器官分离淋巴样细胞的方法。在一些实施方案中，肝脏类器官是通过本文公开的任何一种方法产生的任何一种肝脏类器官。在一些实施方案中，淋巴样细胞从通过本文所述的任何一种方法产生的任何一种肝脏类器官分离。在一些实施方案中，淋巴样细胞包括B细胞、T细胞、NK细胞或共同淋巴样祖细胞中的一种或多种。在一些实施方案中，B细胞是B1细胞。在一些实施方案中，B细胞是B2细胞。在一些实施方案中，B细胞是B1细胞和B2细胞二者。在一些实施方案中，在分离淋巴样细胞之前，该方法包括从肝脏类器官制备单细胞悬液并在基质细胞上培养单细胞悬液。在一些实施方案中，在基质细胞上培养单细胞悬液扩增单细胞悬液中的淋巴样细胞。在一些实施方案中，基质细胞是MS
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5细胞。在一些实施方案中，单细胞悬液与FLT3配体、SCF或IL
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7中的一种或多种或其任何组合接触。在一些实施方案中，B1细胞是CD20
+
CD43
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CD27
+
。在一些实施方案中，通过从单细胞悬液中分选细胞群进行B1细胞的分离，所述细胞群是CD20
+
、CD43
+
、CD27
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中的一种或多种或其任意组合。
[0013]本公开的一些方面涉及淋巴样细胞。在一些实施方案中，淋巴样细胞是通过本文所述的任何一种方法产生的淋巴样细胞。在一些实施方案中，淋巴样细胞是B1细胞，并且B1细胞是通过本文所述的任何一种方法产生的B1细胞。
[0014]本公开的一些方面涉及扩增造血干细胞群的方法。在一些实施方案中，该方法包括培养与肝脏类器官接触的造血干细胞群。在一些实施方案中，肝脏类器官包括造血生态位环境。在一些实施方案中，肝脏类器官是通过本文所述本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种产生造血干细胞(HSC)的肝脏类器官的生产方法，包括：在足以将前肠球状体分化为肝脏类器官的条件下培养所述前肠球状体；其中所述肝脏类器官包含分化成造血干细胞的CD34
+
成血内皮细胞群；和其中所述前肠球状体包含间充质。2.根据权利要求1所述的方法，其中培养所述前肠球状体还包括使所述前肠球状体与Notch激活剂或配体接触。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述Notch激活剂或配体包含DLL1、DLL3、DLL4、JAG1或JAG2中的一种或多种或其任何组合。4.根据权利要求2或3所述的方法，其中所述Notch激活剂或配体包含表达DLL1、DLL3、DLL4、JAG1或JAG2中的一种或多种或其任何组合的细胞。5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述前肠球状体还包含表达一种或多种Notch激活剂或配体的细胞，所述Notch激活剂或配体选自DLL1、DLL3、DLL4、JAG1或JAG2或其任何组合。6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述前肠球状体表达一种或多种Notch激活剂或配体，所述Notch激活剂或配体选自DLL1、DLL3、DLL4、JAG1或JAG2或其任何组合。7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中培养所述前肠球状体还包括使所述前肠球状体与IL
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3、IL
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34或GM
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CSF中的一种或多种或其任何组合接触。8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中培养所述前肠球状体还包括使所述前肠球状体与干细胞因子(SCF)或血小板生成素(TPO)或两者接触。9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中培养所述前肠球状体不包括使所述前肠球状体与视黄酸(RA)接触。10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中培养所述前肠球状体不包括使所述前肠球状体与地塞米松、制瘤素M或肝细胞生长因子中的一种或多种或其任何组合接触。11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述造血干细胞不外源性表达ERG、HOXA5、HOXA9、HOXA10、LCOR、RUNX1、SPI1、FOSB或GFI1中的一种或多种或其任何组合。12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括从所述肝脏类器官分离成血内皮细胞群或造血干细胞或两者。13.根据权利要求12所述的方法，其中分离所述成血内皮细胞群或造血干细胞或两者是通过从所述肝脏类器官中分选为CD34+、CD45+或两者的细胞群进行的。14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括：在足以将诱导多能干细胞分化成定形内胚层的条件下培养所述诱导多能干细胞；和在足以将所述定形内胚层分化为前肠球状体的条件下培养所述定形内胚层；然后在足以将所述前肠球状体分化为所述肝脏类器官的条件下培养所述前肠球状体。15.由前述权利要求中任一项所述的方法产生的肝脏类器官。16.由前述权利要求中任一项所述的方法产生的成血内皮细胞群。17.由前述权利要求中任一项所述的方法产生的造血干细胞。18.根据权利要求1
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14中任一项所述的方法，还包括从所述肝脏类器官中分离淋巴样细胞。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述淋巴样细胞包括B细胞、T细胞、NK细胞或共同淋巴样祖细胞中的一种或多种。20.根据权利要求19所述的方法，其中所述B细胞是B1细胞或B2细胞，或两者。21.根据权利要求18
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20中任一项所述的方法，还包括从所述肝脏类器官制备单细胞悬液并在分离所述淋巴样细胞之前在基质细胞上培养所述单细胞悬液，其中在...

【专利技术属性】
技术研发人员：武部贵则，K，
申请(专利权)人：儿童医院医学中心，
类型：发明
国别省市：