解旋白蛋白水凝胶及其制备方法技术

本发明专利技术公开解旋白蛋白水凝胶及其制备方法，以尿素为变性剂、以谷胱甘肽为还原剂将牛血清白蛋白中链内的二硫键还原为巯基，使其重新组装成链间的二硫键。使用这种方法制备的水凝胶，不仅有良好的生物相容性，而且制备工艺简单、在生理条件下可注射、力学性能良好。

Unrotating albumin hydrogel and its preparation method

【技术实现步骤摘要】
解旋白蛋白水凝胶及其制备方法
本专利技术属于具有良好生物相容性的医用水凝胶领域，更加具体地说，涉及以尿素为变性剂、以谷胱甘肽为还原剂制备的解旋蛋白水凝胶及其制备方法。
技术介绍
水凝胶具有三维网络结构并且含水量高，有很强的可变性，原位可注射水凝胶可将手术创伤降至最小，已被广泛用于药物运输和再生医学。用于制作凝胶的材料可分为天然材料和合成材料，但是天然材料由于自身结构的限制，往往机械性能较差。近年来，为改变这一情况，研究者通常采用两种方法：一是将两种蛋白或将蛋白与其他大分子复合制备双网络水凝胶，二是设计多肽，使其自组装形成水凝胶。但是这两种方法制备工艺复杂且不能保证凝胶的生物相容性。牛血清白蛋白(BSA)，由于其良好的溶解性和生物相容性受到广泛关注，已有许多以BSA为原料制备的水凝胶，比如用含有特定基团的材料修饰BSA表面，使修饰后的BSA在生理条件下可形成凝胶，但这种方法操作复杂，制备过程中引入的物质过多且制备周期长；还有使用热变性BSA或者用二硫苏糖醇(DTT)还原的BSA制备的水凝胶，但是这些水凝胶往往力学性能差，而且不适用于人体条件，不能实现生理条件下的可注射。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，为了解决以天然高分子为原料制备的水凝胶力学性能差，以合成高分子为原料的水凝胶生物相容性差的问题，提出以BSA为原料制备可注射水凝胶的方法。本专利技术的技术目的通过下述技术方案予以实现：解旋白蛋白水凝胶及其制备方法，以牛血清白蛋白(BSA)为原料，尿素为变性剂，谷胱甘肽为还原剂进行制备，按照下述步骤进行：步骤1，将牛血清白蛋白置于尿素的PBS溶液中，室温20—25摄氏度下进行震荡反应，以使牛血清白蛋白进行解旋，得到牛血清白蛋白的解旋溶液；其中PBS溶液为磷酸钠缓冲溶液，pH为7—8；将牛血清白蛋白置于尿素的PBS溶液中，每毫升PBS溶液中尿素和牛血清白蛋白的质量比为(1.5—5.5)：1；在步骤1中，震荡反应时间为10—60min。在步骤1中，PBS溶液的pH为7.5—8。在步骤1中，尿素和牛血清白蛋白的质量比为(2.5—5)：1。步骤2，向步骤1制备的牛血清白蛋白的解旋溶液中加入还原剂谷胱甘肽混合均匀后，在35—38摄氏度下进行恒温加热，以形成水凝胶，其中每毫升解旋溶液中谷胱甘肽和原料牛血清白蛋白的质量比为(0.01—0.15)：1。在步骤2中，在36—37摄氏度下恒温加热反应3—5min。在步骤2中，谷胱甘肽和原料牛血清白蛋白的质量比为(0.05—0.12)：1。在步骤2中，使用倒置法判断凝胶是否形成，将盛有溶液的装置(离心管)倒置10min，若无液体流动即认为已成胶。本专利技术选用的材料：BSA，一种白蛋白，白蛋白是血清中含量最多的蛋白；尿素，常用作蛋白质变性剂，以研究蛋白质一级结构；谷胱甘肽是一种含巯基的三肽，广泛存在于人体细胞中，可还原二硫键，这三种材料均是理想的生物材料。因此，本专利技术以尿素为变性剂、以谷胱甘肽为还原剂将BSA中链内的二硫键还原为巯基，使其重新组装成链间的二硫键。使用这种方法制备的水凝胶，不仅有良好的生物相容性，而且制备工艺简单、在生理条件下可注射、力学性能良好。本专利技术制备了可原位注射、生物相容性好并且有一定力学强度的白蛋白水凝胶。上述水凝胶的凝胶时间可控制在5分钟内，凝胶溶液可以从针头中打出(实现可注射性能)，形成的凝胶呈透明淡黄色。从压缩和流变结果来看，其力学性能较好，压缩和储能模量均可达到KPa级别。本专利技术所用原料均存在于人体中，使用天然高分子为原料保证了水凝胶良好的生物相容性，细胞实验结果显示细胞存活率在90％以上。而且，本专利技术所采用的方法操作简单、原材料易得且无毒，合成成本低。附图说明图1是本专利技术中BSA解旋结构的稳态荧光光谱测试曲线图。图2是本专利技术解旋白蛋白水凝胶从针管中打出的效果图。图3是本专利技术解旋白蛋白水凝胶凝胶前后对比效果图。图4是本专利技术解旋白蛋白水凝胶的力学测试曲线图。图5是本专利技术解旋白蛋白水凝胶的流变测试曲线图。图6是本专利技术解旋白蛋白水凝胶的细胞毒性测试结果图。具体实施方式下面结合附图及实施例对本专利技术做进一步说明。选择用pH＝8.0的PBS缓冲液进行尿素、牛血清白蛋白和谷胱甘肽的溶解和反应，首先进行BSA解旋结构的制备和表征，使用JobinYvinFluorolog3-21稳态荧光光谱仪进行表征，具体过程如下：(1)用pH＝8.0的PBS溶解尿素，尿素浓度为0-9M；(2)分别将10mgBSA溶解在1ml不同浓度的尿素溶液中，震荡反应10min；(3)取1ml(2)中的BSA溶液，加入0.003g谷胱甘肽，震荡10min；(4)在激发波长280nm条件下测试溶液最大发射波长及吸收强度。如图1所示，从图中可以看出吸收峰的最大发射波长在尿素浓度＜4M时未有明显变化，即BSA构象未发生明显改变；在4-5M时略有蓝移，这是由于色氨酸残基所处微环境的极性减小，疏水性增加，即BSA的结构变得更为紧密；在＞5M时红移，说明色氨酸残基所处的微环境疏水性降低，亲水性增强，BSA结构完全打开，符合尿素存在时蛋白结构变化。然后进行解旋白蛋白水凝胶的制备，选择用pH＝8.0的PBS缓冲液溶解尿素，再向尿素溶液中加入BSA粉末，反应1小时使BSA完全解旋；最后加入谷胱甘肽粉末，使被尿素暴露出来的BSA中的17个二硫键打开，37℃恒温加热5min即可形成水凝胶，在每毫升pH＝8.0的PBS缓冲液溶中，尿素、谷胱甘肽和BSA的质量比(1)1.8:0.01:1；(2)2.7:0.015:1；(3)5.4:0.03:1，震荡反应选择震荡机械最高档为10挡进行处理即可。压缩实验：使用DWD-05电子式万能材料试验机进行测试。按照
技术实现思路
制备3组直径在20mm、高度在10mm的圆形水凝胶，然后以5N/min的速度压缩凝胶。如附图4所示，表示水凝胶压缩性能的应力-应变曲线，从图中可以看出(1)以质量比尿素：谷胱甘肽：BSA＝1.800：0.010：1制备的水凝胶的压缩应力最大，可达到0.2531Mpa，但是应变仅为50％。(2)以质量比尿素：谷胱甘肽：BSA＝5.400：0.030：1制备的水凝胶压缩应力最小仅为0.1120MPa，应变也只有53％。(3)以质量比尿素：谷胱甘肽：BSA＝2.700：0.015：1制备的水凝胶的应变最大，可达60.7％，最大压缩应力为0.1505MPa，性能最佳。流变实验：使用DHR-2流变仪测试水凝胶流变性能。按照
技术实现思路
制备3组直径在8-9mm、高度在6-10mm的圆柱形水凝胶。在37℃，固定应变10％，测试频率1-10HZ范围内的储能模量。如附图5所示，图为表示水凝胶流变性能的模量-频率图，从图中可以看出：⑴以质量比尿素：谷胱甘肽：BSA＝1.800：0.010：1制备的水凝胶的储能模量最大，可达到16000Pa。(2)以质量比尿素：谷胱甘肽：BSA＝5.400：0.030：1制备的水凝胶的储能模量最小，仅为6000Pa。(3)以质量比尿素：谷胱甘肽：BSA＝2.700：0.015：1制备的水凝胶的储能模量可达到13500Pa。因此，综合水凝胶的压缩性能与流变性能来看，三种原料以质量比2.700：0.015：1制备出的水凝胶力学性能最优。使用MT本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.解旋白蛋白水凝胶，其特征在于，以牛血清白蛋白为原料，尿素为变性剂，谷胱甘肽为还原剂进行制备，将牛血清白蛋白中链内的二硫键还原为巯基，使其重新组装成链间的二硫键；按照下述步骤进行：步骤1，将牛血清白蛋白置于尿素的PBS溶液中，室温20—25摄氏度下进行震荡反应，以使牛血清白蛋白进行解旋，得到牛血清白蛋白的解旋溶液；其中PBS溶液为磷酸钠缓冲溶液，pH为7—8；将牛血清白蛋白置于尿素的PBS溶液中，每毫升PBS溶液中尿素和牛血清白蛋白的质量比为(1.5—5.5)：1；步骤2，向步骤1制备的牛血清白蛋白的解旋溶液中加入还原剂谷胱甘肽混合均匀后，在35—38摄氏度下进行恒温加热，以形成水凝胶，其中每毫升解旋溶液中谷胱甘肽和原料牛血清白蛋白的质量比为(0.01—0.15)：1。

【技术特征摘要】
1.解旋白蛋白水凝胶，其特征在于，以牛血清白蛋白为原料，尿素为变性剂，谷胱甘肽为还原剂进行制备，将牛血清白蛋白中链内的二硫键还原为巯基，使其重新组装成链间的二硫键；按照下述步骤进行：步骤1，将牛血清白蛋白置于尿素的PBS溶液中，室温20—25摄氏度下进行震荡反应，以使牛血清白蛋白进行解旋，得到牛血清白蛋白的解旋溶液；其中PBS溶液为磷酸钠缓冲溶液，pH为7—8；将牛血清白蛋白置于尿素的PBS溶液中，每毫升PBS溶液中尿素和牛血清白蛋白的质量比为(1.5—5.5)：1；步骤2，向步骤1制备的牛血清白蛋白的解旋溶液中加入还原剂谷胱甘肽混合均匀后，在35—38摄氏度下进行恒温加热，以形成水凝胶，其中每毫升解旋溶液中谷胱甘肽和原料牛血清白蛋白的质量比为(0.01—0.15)：1。2.根据权利要求1所述的解旋白蛋白水凝胶，其特征在于，在步骤1中，震荡反应时间为10—60min。3.根据权利要求1所述的解旋白蛋白水凝胶，其特征在于，在步骤1中，PBS溶液的pH为7.5—8；尿素和牛血清白蛋白的质量比为(2.5—5)：1。4.根据权利要求1所述的解旋白蛋白水凝胶，其特征在于，在步骤2中，在36—37摄氏度下恒温加热反应3—5min。5.根据权利要求1所述的解旋白蛋白水凝胶，其特征在于，在步骤2中，谷胱甘肽和原料牛血清白蛋白的质量比为(0.05—0.12)：1。6.解旋白蛋白水凝胶的制备方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵瑾，白钰，李思迪，李学平，侯信，原续波，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津,12