本发明专利技术涉及用于通过在真核细胞中共表达两种融合蛋白来在真核细胞中产生寡聚蛋白质的方法，所述两种融合蛋白包括蛋白质‑S‑标签融合蛋白，其中所述蛋白质为抗原或抗体；和S‑蛋白‑尾片段(tp)融合蛋白。进一步地，本发明专利技术涉及至少包含蛋白质‑S‑标签融合蛋白和S‑蛋白‑尾片段(tp)融合蛋白的寡聚蛋白质，其中所述蛋白质‑S‑标签融合蛋白中的蛋白质为抗原或抗体；以及在疫苗中的用途。
Plant-derived oligomer vaccine via S-label-S-protein fusion
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通过S-标签-S-蛋白融合物的来自植物的寡聚体疫苗本专利技术涉及用于通过在真核细胞中共表达两种融合蛋白来在真核细胞中产生寡聚蛋白质的方法，寡聚蛋白质，以及其在疫苗中的用途。现有技术甲型流感病毒(负链有包膜正黏病毒)属于最严重的呼吸系统病原体。它们引起严重的和可能致死的疾病(Cox等人,2004)。预期高度致病的禽流感病毒将会引起下一次全球大流行病威胁，这是由于容易由禽类宿主扩散以及其直接感染人类的能力(Yen和Webster,2009)。因此，开发出有效且廉价的疫苗接种策略是即将出现的需求。处于研究的焦点中的是来自植物的亚单位疫苗。Topp等人公开了在植物中重组地产生蛋白质(Topp等人,2016)。一项最近开发出的策略是通过将血凝素基因克隆到经充分表征的载体中和瞬时表达来在烟草物种本氏烟草(N.benthamiana)中产生基于病毒样颗粒的疫苗(Landry等人,2010；D’Aoust等人,2008)。不利的是，该策略包括下游加工步骤，例如几次过滤、渗滤、连续流离心和切向流过滤，或者备选地，色谱方法。备选地，在本氏烟草叶细胞的内质网(ER)中瞬时产生三聚血凝素，以避开限制例如高的下游成本和低的病毒样颗粒的表达水平(Phan等人,2013)。关于三聚化，将血凝素在C末端处与三聚基元GCN4-pII相融合(Harbury等人,1993)。Czajkowsky等人公开了使用Fc融合蛋白作为疫苗(Czajkowsky等人,2012)，其中所述Fc融合物通过增加血浆半寿期、增加与Fc受体的相互作用以及增加可溶性和稳定性而增加了抗原的治疗活性。Louveiro等人描述了基于血凝素-Fc融合蛋白的流感疫苗(人H1、H3流感病毒和禽H5流感病毒)(Loureiro等人,2011)。US7,067,110B1公开了用于增强蛋白质和肽抗原的免疫原性的Fc-融合蛋白，其中将所述抗原与免疫球蛋白重链恒定区(CH2、CH3、CH4)相融合。进一步地，所述疫苗包含用于增强或调节特定免疫应答的佐剂，优选地人细胞因子。抗原选自前列腺特异性膜抗原、细胞因子受体的胞外结构域、病毒蛋白质或肿瘤特异性蛋白质。备选地，通过使用具有S-标签的抗原融合蛋白，描述了用于在疫苗中使用的抗原的纯化。US7,311,918B2公开了轮状病毒亚单位疫苗，其包含具有选自麦芽糖结合蛋白、多组氨酸残基、S-标签、谷胱甘肽-S-转移酶等的融合伙伴(其防止轮状病毒融合蛋白发生复合物形成并且有助于纯化)的重组轮状病毒融合蛋白。US2013/0164296A1公开了作为亚单位疫苗免疫原的连接有例如麦芽糖结合蛋白、S-标签或谷胱甘肽-S-转移酶的融合蛋白，其中融合蛋白伙伴可以防止病毒融合蛋白装配成多聚形式。Asai等人公开了在S-标签(源自人核糖核酸酶1的氨基末端15-氨基酸肽)(人S-标签)与S-蛋白(人核糖核酸酶1的残基21至124)之间的特异性相互作用的用途，所述用途为将酶位点特异性地缀合至抗体以便靶向药物递送以用于癌症治疗(Asai等人,2005)。相反地，US2013/0039942A1公开了关于针对微生物和肿瘤的自辅佐性疫苗的组合物和方法，其中将多聚化-细胞内细胞传导盒插入到病毒或载体中。Wei等人(Wei等人,2008)描述了就其作为疫苗的潜在效力来比较各种形式的重组血凝素(HA)蛋白，单体、三聚和寡聚H5N1HA蛋白。在粉纹夜蛾(Trichoplusiani)(Hi5)细胞中(作为高分子量寡聚体(1,321kDa)和三聚体(214kDa))和在人胚胎肾细胞系293F中表达了重组单体、三聚和寡聚H5N1HA蛋白。HA的高分子量寡聚体引发了最强的抗体应答，接着是三聚HA，而单体HA显示出最小的效力。因此，对于用于产生具有在诱导潜在中和抗体方面的经改善的免疫原性、低的下游成本和高的表达水平的疫苗的方法，仍然存在需要。本专利技术的目标本专利技术的目标为找到有效且快速的疫苗接种策略，以及用于产生寡聚蛋白质(优选地用作疫苗)的容易且快速的方法。本专利技术的特征本专利技术的目标通过用于在真核细胞中产生寡聚蛋白质的方法而得到解决，所述方法包括下列步骤：a)在真核细胞中共表达两种融合蛋白，其包括-包含蛋白质和S-标签的第一融合蛋白(在下文中也称为蛋白质-S-标签融合蛋白)，其中所述蛋白质为抗原或抗原结合单元，和-包含S-蛋白和尾片段(tp)的第二融合蛋白(在下文中也称为S-蛋白-尾片段(tp)融合蛋白)，其中所述尾片段(tp)为源自IgM或IgA抗体的重链的寡肽，b)提取所述两种融合蛋白，其中所述蛋白质-S-标签融合蛋白中的蛋白质的寡聚化在根据步骤a)在真核细胞中进行共表达后和/或在根据步骤b)进行提取后发生。有利地，根据本专利技术的用于在真核细胞中产生寡聚蛋白质的方法是快速的且便宜的。当在上文和下文中参考一些文献时，在需要的情况下，将这些文献合并。在本文中所使用的术语“寡聚(体)”是指由少数单体单元组成的分子复合物，其中少数是指2至20，优选地2至9。根据本专利技术的寡聚蛋白质为蛋白质-S-标签融合蛋白-S-蛋白-尾片段融合蛋白复合物这一单体单元的同寡聚体。在本文中所使用的术语“寡聚化”是指将单体或单体混合物转变为寡聚体的过程。根据本专利技术的真核细胞为包含细胞核和其他包封在膜内的细胞器的细胞。有利地，真核细胞展现出蛋白质二硫键异构酶。在本文中所使用的术语“蛋白质二硫键异构酶”是指在真核生物中在内质网中的这样的酶，其催化在蛋白质内在半胱氨酸残基之间的二硫键的形成和断裂。在一个实施方案中，所述真核细胞选自植物细胞或酵母细胞。在本文中所使用的术语“植物细胞”是指植物界的多细胞真核生物。在本文中所使用的术语“酵母细胞”是指真菌界的单细胞真核微生物。在一个优选的实施方案中，真核细胞为植物细胞。有利地，在植物细胞中的表达提供低的生产成本、生产安全性、易于扩大规模、低的基础设施成本以及寡聚蛋白质的高的稳定性和保存期限。进一步有利地，植物细胞能够提供复杂的、经正确折叠的和经翻译后修饰的蛋白质。在一个实施方案中，所述植物细胞为植物的叶或种子的细胞。在一个实施方案中，所述植物细胞为烟草、大豆或豌豆植物的细胞。在一个优选的实施方案中，所述植物细胞为本氏烟草的叶细胞。有利地，重组抗体显示出在种子中的高的积累和长期稳定性(Fiedler和Conrad,1995)。在一个进一步的实施方案中，所述酵母细胞为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的细胞。在本文中所使用的术语“共表达”是指两个或更多个基因的同时表达。在本文中所使用的术语“融合蛋白”是指通过连接原来编码分开的蛋白质的两个或更多个基因而产生的蛋白质。该融合基因的翻译导致具有源自原始蛋白质中的每一个的功能特性的单个蛋白质。根据本专利技术的抗原为能够在宿主生物中诱导免疫应答的蛋白质，其中免疫系统产生针对所述抗原的抗体。在一个实施方案中，所述抗原为病毒粒子的膜蛋白或表面蛋白，优选地血凝素。在一个进一步的实施方案中，血凝素为流感血凝素、麻疹血凝素、副流感血凝素-神经氨酸酶或腮腺炎血凝素-神经氨酸酶。在一个优选的实施方案中，血凝素选自人H1、H3流感病毒或禽H5流感病毒，优选地选自禽H5流感病毒(特别地，SEQIDNO.1、35或36)。在一个进本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.用于在真核细胞中产生寡聚蛋白质的方法，其包括下列步骤：a)在真核细胞中共表达两种融合蛋白，其包括‑包含蛋白质和S‑标签的第一融合蛋白(在下文中也称为蛋白质‑S‑标签融合蛋白)，其中所述蛋白质为抗原或抗原结合单元，和‑包含S‑蛋白和尾片段(tp)的第二融合蛋白(在下文中也称为S‑蛋白‑尾片段(tp)融合蛋白)，其中所述尾片段(tp)为源自IgM或IgA抗体的重链的寡肽，b)提取所述两种融合蛋白，其中所述蛋白质‑S‑标签融合蛋白中的蛋白质的寡聚化在根据步骤a)在真核细胞中进行共表达后和/或在根据步骤b)进行提取后发生。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.12.22 EP 16206231.91.用于在真核细胞中产生寡聚蛋白质的方法，其包括下列步骤：a)在真核细胞中共表达两种融合蛋白，其包括-包含蛋白质和S-标签的第一融合蛋白(在下文中也称为蛋白质-S-标签融合蛋白)，其中所述蛋白质为抗原或抗原结合单元，和-包含S-蛋白和尾片段(tp)的第二融合蛋白(在下文中也称为S-蛋白-尾片段(tp)融合蛋白)，其中所述尾片段(tp)为源自IgM或IgA抗体的重链的寡肽，b)提取所述两种融合蛋白，其中所述蛋白质-S-标签融合蛋白中的蛋白质的寡聚化在根据步骤a)在真核细胞中进行共表达后和/或在根据步骤b)进行提取后发生。2.权利要求1的方法，其中所述真核细胞为选自烟草、大豆或豌豆属(Pisum)植物的植物细胞。3.权利要求1或2的方法，其中所述植物细胞为植物的叶或种子的细胞。4.权利要求2至3之一的方法，其中根据步骤a)的共表达包括下述步骤：通过用土壤杆菌菌株共渗入植物细胞来在植物细胞中提供编码所述两种融合蛋白的基因。5.寡聚蛋白质，其至少包含：包含蛋白质和S-标签的第一融合蛋白，其在下文中也称为蛋白质-S-标签融合蛋白，其中所述蛋白质为抗原或抗原结合单元；和包含S-蛋白和尾片段(tp)的第二融合蛋...
【专利技术属性】
技术研发人员：H·法恩，U·康拉德，T·T·胡，
申请(专利权)人：莱布尼兹植物遗传学和文化植物研究所IPK，
类型：发明
国别省市：德国,DE
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