一种基于CRISPRCas9介导CsWRKY22定点编辑提高柑橘溃疡病抗性的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于CRISPRCas9介导CsWRKY22定点编辑提高柑橘溃疡病抗性的方法，属于植物基因工程领域，通过构建S1和S2 sgRNA指导的CRISPR/Cas9编辑载体，利用农杆菌介导法转化晚锦橙上胚轴，使CsWRKY22蛋白功能丧失或减少，实现了CsWRKY22基因在柑橘基因组中的成功编辑，获得CsWRKY22突变体转基因植株，增强植株对柑橘溃疡病的抗性，获得溃疡病抗性高的柑桔。

A Method for Improving Resistance to Citrus Canker Disease Based on CRISPRCas9 Mediated CsWRKY22 Fixed Editing

【技术实现步骤摘要】
一种基于CRISPRCas9介导CsWRKY22定点编辑提高柑橘溃疡病抗性的方法
本专利技术涉及植物基因工程领域，具体涉及一种基于CRISPRCas9介导CsWRKY22定点编辑提高柑橘溃疡病抗性的方法。
技术介绍
柑橘溃疡病是世界柑橘生产上最具毁灭性的病害之一。几乎能危害所有的柑橘品种。柑橘溃疡病菌通过侵染柑橘的叶片、枝条以及果实从而引起落叶、枯枝和落果，导致果品产量下降，品质变劣，严重影响柑橘的经济价值。柑橘溃疡病病原菌为柑橘黄单胞杆菌致病变种Xanthomonascitrisubsp.citri(Xcc)，该病原菌是热带和亚热带国家商业柑橘中最具破坏性的病原体之一，形状呈杆状，是革兰氏阴性细菌，具有一个极性鞭毛，生长在好氧的环境，定殖于寄主组织的细胞间隙。目前，柑橘生产上尚无从根本上解决柑橘溃疡病病害的技术措施，只能采取销毁发病植株或发病果园等一系列破坏性措施，来彻底清除柑橘溃疡病。为此，对果农来说，经济损失非常严重。针对柑橘溃疡病问题无法完全解决，因此需要寻找更好的方法。利用抗性种质资源，结合植物基因工程手段挖掘抗病基因，并培育抗病品种增强柑橘对溃疡病的抗性，是最为经济，同时也是从根本上解决这一难题的最为有效的途径。由于柑橘中大部分品种都有雄(雌)性不育、较长的童期、基因组高度的杂合、多胚性及珠心胚干扰严重等的特点，通过常规育种方法进行柑橘溃疡病抗性改良是困难且耗时的。与传统育种相比，植物基因工程具有周期短、效率高以及可控性强等优点，已成为柑橘品种改良一种重要手段。自1989年Kobayashi等利用原生质体为受体获得转基因胚性愈伤以来，柑橘转基因技术研究取得了较大的进展。中国农业科学院柑桔研究所陈善春等[6]进行柑橘抗溃疡病基因工程育种研究，先后将抗菌肽D基因、CecropinB基因和ShivaA基因双基因转入溃疡病高度易感的主栽柑桔品种锦橙、新会橙、沙田柚、脐橙等中，经过转基因植株温室和田间抗病性评价，筛选到11个转基因株系对柑橘溃疡病感病性显著降低。随后，许多与抗病相关的外源基因相继被导入柑橘基因组中，并获得了许多形状改良的转基因材料，比如水稻Xa21、欧文氏菌hrpN、苹果MdSPDS、辣椒Bs2基因等，这些基因均不同程度地提高了转基因植株对柑橘溃疡病的抗病性。通过转入抗体基因的方法获得柑橘抗溃疡病体系的研究也取得了一定成果。例如，pthA基因是柑橘溃疡病亚洲型菌系的致病基因，胡春华等克隆出pthA基因，并制备出pthA抗体得到了单链抗体基因并导入甜橙中，获得了溃疡病抗性提高的转基因植株。特别是，近年来开始兴起的CRISPR/Cas9技术已成为柑橘品种改良的重要途径之一，该技术能通过定向精确的修饰基因组，在动植物基因功能和作物遗传改良研究中得到广泛应用。最近，CRISPR/Cas9技术已成功用于柑橘分子生物学研究中。Peng等对柑橘溃疡病感病基因CsLOB1启动子进行CRISPR/Cas9靶向敲除从而获得了对柑橘溃疡病抗性显著提高的株系。同时，美国弗罗里达大学Jia等利用CRISPR/Cas9技术对邓肯葡萄柚中CsLOB1基因编码序列进行编辑，成功得到六株编辑突变体株系，对突变体株系进行抗病性评价，接种溃疡病病菌四天后有四株无明显症状产生，虽在接种后期发生病变，但病变组织与野生型相比较小，且其中有两株对柑橘溃疡病表现了明显的抗性。以上研究结果暗示，在柑橘中敲除溃疡病感病相关基因可能会增强柑橘对溃疡病的抗性。我们实验室前期研究表明，植物免疫反应PTI(PAMP-triggeredimmunity)的标志基因CsWRKY22与柑橘品种溃疡病感病性紧密相关，在晚锦橙中超量表达CsWRKY22显著增强了植株对溃疡病的感病性，暗示CsWRKY22是柑橘溃疡病的一个感病基因，但沉默或敲除CsWRKY22能否增强柑橘溃疡病抗性有待深入研究。因此，本专利技术拟在此基础上，进一步利用CRISPR/Cas9技术对柑橘CsWRKY22基因进行编辑，以期获得对溃疡病有显著抗性的突变体柑橘株系。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术公开一种基于CRISPRCas9介导CsWRKY22定点编辑提高柑橘溃疡病抗性的方法，该方法对柑橘感病基因CsWRKY22进行定点编辑，获得溃疡病抗性高的柑桔。本专利技术通过下述技术方案实现：一种基于CRISPRCas9介导CsWRKY22定点编辑提高柑橘溃疡病抗性的方法，利用CRISPR/Cas9技术定点突变柑橘感病基因CsWRKY22，使其蛋白功能丧失或减少，增强植株对柑橘溃疡病的抗性，获得溃疡病抗性提高的柑桔。其中，柑橘感病基因CsWRKY22为CsWRKY22G和CsWRKY22c等位基因，含有两个内含子和三个外显子。用于编辑CsWRKY22的植物表达载体为含有特异靶向CsWRKY22基因sgRNA引导序列的CRISPR/Cas9载体。CsWRKY22G和CsWRKY22c的编码序列如SEQIDNo：9和SEQIDNo：10所示。进一步的，用于高效特异指导Cas9编辑CsWRKY22基因的sgRNA序列为S1，S2，S3，S4。进一步的，用于创制突变体的转化方法为农杆菌介导的柑橘遗传转化方法，具体为：将CsWRKY22基因sgRNA引导序列的CRISPR/Cas9载体导入柑橘中，实现CsWRKY22基因定点突变，并获得抗性显著提高的突变体植株。所述突变体植株包括CsWRKY22序列突变的转基因植株和材料。具体的，上述方法包括以下几个步骤：1)获得柑橘CsWRKY22基因组序列；2)获得敲除CsWRKY22基因所需的sgRNA序列；3)将步骤2)中得到的sgRNA序列构建Cas9植物表达载体；4)将步骤3)得到的植物表达载体整合到柑橘基因组中；5)将通过步骤4)获得的柑橘进行进一步的培养，栽培，并获得转基因的柑橘植株；6)将通过步骤5)获得的转基因柑橘进行进一步的检测筛选出突变体植株；7)将通过步骤6)获得的突变体植株进行进一步的溃疡病抗性评价。其中，步骤1)中所述的CsWRKY22基因组序列是以晚锦橙DNA为模板克隆得到的。其中，步骤2)中所述的敲除CsWRKY22基因所需的sgRNA序列首先由步骤1中克隆得到的CsWRKY22基因序列特征为模板，利用体外活性检测筛选得到的。其中，步骤3)中所述的sgRNA序列与Cas9植物表达载体融合以构建表达载体的方法为本领域的常规方法，使用的载体是质粒载体puc119-gRNA和植物表达载体PGN-pcocas9。其中，步骤4)中所述的将表达载体整合到柑橘的基因组所使用的方法为常用的植物转基因方法，比如根癌农杆菌介导法或基因枪法。其中，步骤6)中所述的筛选突变体植株是利用常规的T-克隆检测法。其中，步骤7)中所述的溃疡病抗性评价方法是利用离体接菌法。本专利技术与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：本专利技术一种基于CRISPRCas9介导CsWRKY22定点编辑提高柑橘溃疡病抗性的方法，通过构建S1和S2sgRNA指导的CRISPR/Cas9编辑载体，利用农杆菌介导法转化晚锦橙上胚轴，获得三株CsWRKY22突变体转基因植株，实现了CsWRKY22基因在柑橘基因组中的成功编辑，从而增强了柑橘溃疡病抗性。附图说明此处所说明的附图用来提供对本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于CRISPRCas9介导CsWRKY22定点编辑提高柑橘溃疡病抗性的方法，其特征在于，利用CRISPR/Cas9技术定点突变柑橘感病基因CsWRKY22，使其蛋白功能丧失或减少，增强植株对柑橘溃疡病的抗性。

【技术特征摘要】
1.一种基于CRISPRCas9介导CsWRKY22定点编辑提高柑橘溃疡病抗性的方法，其特征在于，利用CRISPR/Cas9技术定点突变柑橘感病基因CsWRKY22，使其蛋白功能丧失或减少，增强植株对柑橘溃疡病的抗性。2.根据权利要求1所述的一种基于CRISPRCas9介导CsWRKY22定点编辑提高柑橘溃疡病抗性的方法，其特征在于，所述柑橘感病基因CsWRKY22为CsWRKY22G和CsWRKY22c等位基因，含有两个内含子和三个外显子，CsWRKY22G具有如SEQIDNo：1所示核苷酸序列，CsWRKY22c具有如SEQIDNo：2所示核苷酸序列。3.根据权利要求1所述的一种基于CRISPRCas9介导CsWRKY22定点编辑提高柑橘溃疡病抗性的方法，其特征在于，用于编辑柑橘感病基因CsWRKY22的植物表达载体为含有特异靶向CsWRKY22基因sgRNA引导序列的CRISPR/Cas9载体。4.根据权利要求3所述的一种基于CRISPRCas9介导CsWRKY22定点编辑提高柑橘溃疡病抗性的方法，其特征在于，用于特异指导Cas9编辑Cs...

【专利技术属性】
技术研发人员：邹修平，陈善春，王丽娟，何永睿，彭爱红，龙琴，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：重庆,50