番茄miR6027基因在控制植物果实颜色中的应用方法技术

本发明专利技术公开了番茄miR6027基因在控制植物果实颜色中的应用方法，涉及植物基因的应用，旨在得到一种能够控制miR6027基因的表达，调控果实的颜色的方法。所述番茄miR6027基因在控制植物果实颜色中的应用方法为:利用miR6027前体序列来构建pCambia1300‑SMMT6027沉默表达载体，然后通过农杆菌介导法转化番茄，通过番茄miR6027基因调控果实颜色。本发明专利技术通过构建STTM‑6027沉默表达载体来探究Sl‑miR6027在果实成熟中的功能，既可为基因工程来改善果实颜色提供潜在的基因资源，又可为通过STTM技术开展果实发育相关miRNA的功能研究奠定技术基础。

Application of Tomato Micro6027 Gene in Controlling Plant Fruit Color

【技术实现步骤摘要】
番茄miR6027基因在控制植物果实颜色中的应用方法
本专利技术涉及植物基因的应用方法，具体涉及番茄miR6027基因在控制植物果实颜色中的应用方法。
技术介绍
目前，与果实发育及成熟相关的大量差异表达miRNAs被发现(Zuoetal.2012；GaoCetal.2015)。如：番茄miR161、miR173、miR393、miR397、miR398和miR414只有在绿熟期果实中表达量增加；miR159表达量在破色期果实中下降，到红熟期增加；miR156和miR394在成熟期表达量下降，miR396在破色期表达量明显增加；miR828和miR1917表达在红熟期下降(Zuoetal.2012)。miRNAs不仅在果实成熟各个时期表现出差异表达模式，而且其中一些miRNAs的表达受到乙烯调控，如：番茄miR394、miR414、miR1917的表达受乙烯负调控，而miR156、miR159、miR396、miR482、miR6027则为乙烯诱导表达(Zuoetal.2012；GaoCetal.2015)。香蕉miR156、miR162、miR171、miR393和miR172等受到乙烯诱导表达(Bietal.2015)。一个基因在特定的组织、器官中特异性的特异性表达预示着该基因在特定的组织、器官中发挥着重要作用。Sl-miR6027在番茄果实绿熟期高表达，同时，Sl-miR602的表达受到乙烯的调节，该结果预示其参与调控番茄果实成熟过程，但其作用机制有待于深入研究。果实颜色是重要的品质特征之一，番茄果实的颜色可分为红色，粉红色，橙色，黄色，绿色和紫色，各种颜色反映了果实中类胡萝卜素、叶绿素和类黄酮等的相对水平(Kilambietal.2013；GaoLetal.2016)。其中，类胡萝卜素合成而产生的红色是果实成熟的一个关键指标。已经证明几种具有颜色缺陷的番茄突变体可用于通过类胡萝卜素合成来理解果实颜色形成的分子基础(GaoLetal.2016)。除了类胡萝卜素生物合成途径中的结构基因外，一些参与类黄酮合成和叶绿素降解的基因突变体，如：DDB1，DET1，ZEP及hp-1，hp-2，hp-3等(Galpazetal.2008)，由于番茄红素、类固醇或者叶绿素水平升高，而使果实中具有高水平的色素。光是调节番茄果实发育和成熟过程的一种重要因素(Cruzetal.2018；Zhangetal.2019)。已有研究结果表明，通过对hp1和hp2等位基因的遗传分析揭示了核蛋白DDB1和DET1为光信号转导的负调节因子(Liebermanetal.2004；Liuetal.2004)。沉默S1-DDB1/HP1或S1-DET1/HP2极大地促进了果实组织中质体生物合成和类胡萝卜素的积累(Davulurietal.2004；WangSetal.2008)。此外，研究表明，光信号和植物激素乙烯已被确定为番茄果实成熟过程中类胡萝卜素生物合成的重要调节剂，如：在光照或黑暗条件下，hp2成熟果实中类胡萝卜素的过度积累导致乙烯产量变化、编码成熟相关的调节因子基因表达的增加以及乙烯敏感性增强(马勇etal.2017；Cruzetal.2018)。在本研究中，Sl-miR6027及其潜在靶基因Solyc09g098130的表达水平受到光调节，表明Sl-miR6027及其靶基因可能介导光信号传导来实现对果实成熟过程的调节。反向遗传学主要通过超表达或者沉默表达方法实现对基因功能的研究。利用超表达载体转化植物，从而提高miRNA在体内的表达量的方法是一种已被广泛应用于植物miRNA功能研究的成熟方法(Todescoetal.2010)。但对miRNA功能沉默的方法一直不能取得令人满意的效果。STTM的发现揭示了一种miRNA沉默调控机制，该方法使表型更加明显，对miRNA的抑制程度更深。目前，尽管已有STTM应用于番茄miRNA功能的沉默(Jiangetal.2018；Kravchiketal.2019)，但是，利用STTM抑制果实发育相关miRNA的研究鲜有报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供番茄miR6027基因在控制植物果实颜色中的应用方法，该方法能够控制miR6027的表达，调控果实的颜色。本专利技术的目的通过如下技术方案实现：番茄miR6027基因在控制植物果实颜色中的应用方法，利用miR6027前体序列来构建pCambia1300-SMMT6027沉默表达载体，然后通过农杆菌介导法转化番茄，通过番茄miR6027基因调控果实颜色；所述miR6027前体序列的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。进一步地，所述农杆菌介导法中采用的基因工程菌为农杆菌EHA105。进一步地，构建番茄miR6027基因的沉默表达载体使用的引物组为：F-STTM6027:GGAGAGGACAGGGTACCCGCCGAAGGATTCctaACGAGAAACAGTTGTTGTTGTTATGG；R-STTM6027:CTCTAGAGGATCCCCTGTTTCTCGTctaGAATCCTTCGGCATTCTTCTTCTTTAGACCA。引物F-STTM6027、R-STTM6027的序列分别如SEQIDNO.2、SEQIDNO.3所示。进一步地，所述农杆菌介导法转化番茄的步骤为：将含有所述pCambia-STTM6027质粒的阳性菌接入液体LB培养基中，培养12～16h，然后进行质粒提取，转化到农杆菌EHA105感受态细胞中。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：1.本专利技术通过构建Sl-miR6027的高效沉默载体，可利用农杆菌介导转化番茄，从而实现对番茄果实颜色的控制，实现了对番茄果实颜色的改变。2.本专利技术通过构建STTM-6027沉默表达载体来探究Sl-miR6027在果实成熟中的功能，既可为基因工程来改善果实颜色提供潜在的基因资源，又可为通过STTM技术开展果实发育相关miRNA的功能研究奠定技术基础。附图说明下面结合附图中的具体实施例对本专利技术的技术方案做进一步的详细说明，但不构成对本专利技术的任何限制。图1为Sl-miR6027在番茄果实中的表达模式图；图2为Sl-miR6027启动子顺式作用元件分析图；图3为Sl-miR6027的靶基因预测；图4为靶基因Solyc09g098130的光调节表达模式图；图5为构建STTM-6027载体时的PCR扩增、酶切；图6为pCambia1300-STTM6027沉默载体的结构图；图7为农杆菌PCR阳性克隆的鉴定结果图；图8为转基因番茄的PCR筛选；图9为转基因番茄果实表型图。具体实施方式下述实施例中所使用的方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所选用的材料、试剂等，如无特别说明，均可以从商业途径中获得。实施例1所用材料：大肠杆菌DH5α、农杆菌EHA105、植物表达载体pCamiba-35S来源于玉林师范学院分子生物实验室，克隆载体PEASY-BluntClongKit购于TRANSGENE公司。寡核苷酸由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，DNA聚合酶、限制性内切酶(KpnI,BamHI)和T4连接酶购于ThermoFisherScientific公司，质粒提取试剂盒和凝胶回收试剂盒购于Omega公本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.番茄miR6027基因在控制植物果实颜色中的应用方法，其特征在于，利用miR6027前体序列来构建pCambia1300‑SMMT6027沉默表达载体，然后通过农杆菌介导法转化番茄，通过番茄miR6027基因调控果实颜色。

【技术特征摘要】
1.番茄miR6027基因在控制植物果实颜色中的应用方法，其特征在于，利用miR6027前体序列来构建pCambia1300-SMMT6027沉默表达载体，然后通过农杆菌介导法转化番茄，通过番茄miR6027基因调控果实颜色。2.根据权利要求1所述的番茄miR6027基因在控制番茄果实颜色中的应用方法，其特征在于，所述农杆菌介导法中采用的基因工程菌为农杆菌EHA105。3.根据权利要求1或2所述的番茄miR6027基因在控制番茄果实颜色中的应用方法，其特征在于，构建番茄miR6027基因的沉默表达载体使用的引物组为：F-STTM602...

【专利技术属性】
技术研发人员：任振新，史列琴，
申请(专利权)人：玉林师范学院，
类型：发明
国别省市：广西,45