一种胰岛素质谱肽图的鉴别方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种胰岛素质谱肽图的鉴别方法及应用。本发明专利技术采用V8酶结合V8酶和赖氨酰肽链内切酶联用，特异性水解胰岛素，通过液质联用仪建立含有胰岛素特征性片段的肽图。方法建立：使用缓冲液提供pH7.5～9.5的酶解环境，底物与酶按胰岛素:V8酶:赖氨酰肽链内切酶≈（100～1000）:（100～500）:1的质量比进行反应过夜，反应液稀释10～30倍，采用液相分离质谱检测器检测，建立各品种胰岛素的特征肽图谱。采用本发明专利技术的质谱肽图谱，可以准确的确定各种不同胰岛素，方法准确可靠。

A Method for Identification of Insulin Mass Spectrometric Peptide Map and Its Application

【技术实现步骤摘要】
一种胰岛素质谱肽图的鉴别方法及应用
本专利技术属于药物分析
，涉及一种胰岛素酶解质谱肽图谱的建立方法及应用。
技术介绍
胰岛素类重组产品是目前针对糖尿病最有效和最安全的治疗手段。我国人口基数大，糖尿病患者数量多，胰岛素使用量大。虽然重组技术含量高，生产过程复杂，但在丰厚利润驱动下，存在不法商贩利用动物源性胰岛素以假乱真的风险。目前现行质量标准中，对于重组胰岛素真伪的鉴别采用的是保留时间一致性进行鉴别，而不同种类重组胰岛素分子间结构及其相似，保留时间非常相近，实际鉴别操作过程中存在着一定的困难。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种胰岛素质谱肽图的鉴别方法。本专利技术采用合适的酶解方法，辅以质谱检测，建立各类胰岛素的酶解质谱肽图将大大提高鉴别的准确可靠性，提高胰岛素的鉴别能力，为胰岛素的打假工作提供有力技术支持。为实现上述目的，本专利技术公开了如下的
技术实现思路
：一种胰岛素质谱肽图的鉴别方法，其特征在于按如下的步骤进行：（1）使用V8酶结合V8酶与赖氨酰肽链内切酶联用酶解方法鉴别各种类胰岛素；（2）V8酶与赖氨酰肽链内切酶联用酶解方法鉴别赖脯胰岛素；（3）水解条件：采用Tris-Hcl缓冲液提供pH7.5～9.5的酶解环境；（4）反应液的配制：按照胰岛素:V8酶:赖氨酰肽链内切酶≈（100～1000）:（100～500）:1的质量比分别配制反应液；（5）色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以（0.1%～1%）甲酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，采用梯度洗脱，流速为（0.2～0.6）ml/min，柱温50～60℃，质谱检测器；表1流动相梯度洗脱条件(体积比)（6）测定法：取酶解样品注入液质联用仪，进行数据采集，测定酶解多肽片段的质谱图。本专利技术所述的鉴别方法，其特征在于建立多种胰岛素在两种酶解条件下的特征质谱肽图，为人胰岛素、门冬胰岛素、甘精胰岛素、谷赖胰岛素、赖脯胰岛素、猪胰岛素、牛胰岛素等。本专利技术使用质谱检测器在50~2000Da范围内连续扫描，制定多种胰岛素的酶解质谱肽图。按照本专利技术测定胰岛素的质谱肽图，部分胰岛素特征质谱理论片段结果如下表2、表3：表2胰岛素V8酶水解理论片段总结表表3胰岛素在V8酶与赖氨酰肽链内切酶联用条件下水解理论片段总结表本专利技术所述的胰岛素质谱肽图谱建立包含原料和制剂。其中质谱检测得到4个特征肽段。分别是肽段Ⅰ、肽段Ⅱ、肽段Ⅲ、肽段Ⅳ。本专利技术进一步公开了胰岛素质谱肽图的鉴别方法在准确快速鉴别胰岛素真伪（例如以猪胰岛素注射液冒充门冬胰岛素注射液），鉴别胰岛素具体类别（通过各胰岛素的特征质谱肽图对胰岛素种类实现鉴别）方面的应用。实验结果显示：采用本专利技术的质谱肽图鉴别方法可以准确的鉴别出胰岛素的真伪以及具体类别（见附图1～4）。本专利技术主要解决了胰岛素真伪以及类别的鉴别，重点考察了两种酶解条件下各类胰岛素酶解肽段的稳定性和特异性，主要的难点在于酶解条件的控制和特征酶解肽段的检测分析。本专利技术公开的胰岛素质谱肽图的鉴别方法与现有技术相比所具有的积极效果在于：（1）本专利技术针对多种不同胰岛素建立了相关特异的质谱肽图，在胰岛素鉴别过程中可以准确快速的鉴别出胰岛素的真伪，同时鉴别出胰岛素的具体类别。（2）本专利技术将不再比较供试品与对照品酶解多肽片段的保留时间，在使用质谱检测器替代紫外可见光检测器进行多肽片段测定后，将直接依靠各胰岛素酶解肽段的特征质谱肽图鉴定各胰岛素。附图说明图1重组人胰岛素注射液V8酶水解质谱图图2猪胰岛素注射液V8酶水解质谱图图3重组人胰岛素注射液V8酶及赖氨酰肽链内切酶联用酶解质谱图图4赖脯胰岛素注射液V8酶及赖氨酰肽链内切酶联用酶解质谱图图5门冬胰岛素注射液V8酶水解质谱肽图；图6假冒门冬胰岛素注射液V8酶水解质谱肽图；图7重组人胰岛素色谱图图8猪胰岛素色谱图。具体实施方式下面通过具体的实施方案叙述本专利技术。除非特别说明，本专利技术中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本专利技术的范围，本专利技术的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本专利技术实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本专利技术的保护范围。本专利技术所用原料及试剂均有市售。Tris-Hcl缓冲液自行配置（称取三羟甲基氨基甲烷12.14g，加水800ml搅拌溶解，并稀释至1000ml，用1mol/L盐酸溶液调节pH值。）胰岛素来源市售V8酶来源市售赖氨酰肽链内切酶来源市售实验采用仪器为UPLC—XEVOG2—XsQTof液质联用仪，配备ESI离子源。实施例1重组人胰岛素、门冬胰岛素、赖脯胰岛素及猪胰岛素注射液V8酶水解质谱肽图及V8酶与赖氨酰肽链内切酶联用质谱肽图测定分别各取注射液样品1支，转移至15ml离心管，以适宜Tris-Hcl缓冲液调节样品pH值至8.5，稀释体积至15ml。（1）取稀释样品600μl，加入V8酶200μl（1mg/ml），室温过夜，然后加入400μlTris-Hcl缓冲液；（2）取稀释样品600μl，加入V8酶200μl（1mg/ml）和赖氨酰肽链内切酶50μl（20μg/ml），室温过夜，然后加入400μlTris-Hcl缓冲液。进样前样品稀释20倍。采用WatersACQUITYUPLC®CSHTMC18，1.7μm，50×2.1mm（I.D）色谱柱，按照下表梯度条件，以0.1%甲酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，0.4ml/min流速，60℃柱温，进样5μl测定，采集离子流图；表4流动相梯度洗脱条件（体积比）样品在两种酶解条件下酶解产生的四个特征性多肽片段见表5及表6：表54种胰岛素V8酶水解肽段表表64种胰岛素V8酶及赖氨酰肽链内切酶联用水解肽段表在V8酶及V8酶和赖氨酰肽链内切酶联用条件下，根据两种酶解条件下酶解产生的特征性肽段可以准确鉴别出各种胰岛素的真伪以及胰岛素具体的类别。实施例2重组人胰岛素及赖脯胰岛素注射液V8酶及赖氨酰肽链内切酶联用酶解质谱肽图测定各取注射液样品1支，转移至15ml离心管，以适宜Tris-Hcl缓冲液调节样品pH值至9，稀释体积至15ml。取稀释样品1000μl，加入V8酶100μl（1mg/ml）和赖氨酰肽链内切酶20μl（20μg/ml），室温过夜，然后加入400μlTris-Hcl缓冲液。进样前样品稀释10倍。按照实施例1梯度条件测定，以0.7%甲酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，0.2ml/min流速，55℃柱温，进样5μl，采集离子流图；样品酶解后产生的四个特征性多肽片段见表7：表7重组人胰岛素及赖脯胰岛素V8酶及赖氨酰肽链内切酶联用酶解肽段表在V8酶及V8酶和赖氨酰肽链内切酶联用酶解条件下，重组人胰岛素和赖脯胰岛素可以得到有效鉴别和区分。实施例3门冬胰岛素注射液及假冒门冬胰岛素注射液V8酶水解质谱肽图测定各取注射液样品1支，转移至15ml离心管，以Tris-Hcl缓冲液调节样品pH值至7.5，稀释体积至15ml。取稀释样品1000μl，加入V8酶200μl（1mg/ml），室温过夜，然后加入400μlTris-Hcl缓冲液。进样前样品稀释30倍。按照实施例1梯度条件，以0.5%甲酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，0.6ml/min流速，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种胰岛素质谱肽图的鉴别方法，其特征在于按如下的步骤进行：（1）使用V8酶结合V8酶与赖氨酰肽链内切酶联用酶解方法鉴别各种类胰岛素；（2）V8酶与赖氨酰肽链内切酶联用酶解方法鉴别赖脯胰岛素；（2）水解条件：采用缓冲液pH7.5～9.5的酶解环境；所述的缓冲液指的是Tris‑Hcl缓冲液；（3）反应液的配制：按照胰岛素:V8酶:赖氨酰肽链内切酶≈（100～1000）:（100～500）:1的质量比分别配制反应液；（4）色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以体积比0.1%～1%甲酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，采用梯度洗脱，流速为0.2～0.6ml/min，柱温50～60℃，质谱检测器；（5）色谱梯度条件如下：表1 流动相梯度洗脱条件(体积比)

【技术特征摘要】
1.一种胰岛素质谱肽图的鉴别方法，其特征在于按如下的步骤进行：（1）使用V8酶结合V8酶与赖氨酰肽链内切酶联用酶解方法鉴别各种类胰岛素；（2）V8酶与赖氨酰肽链内切酶联用酶解方法鉴别赖脯胰岛素；（2）水解条件：采用缓冲液pH7.5～9.5的酶解环境；所述的缓冲液指的是Tris-Hcl缓冲液；（3）反应液的配制：按照胰岛素:V8酶:赖氨酰肽链内切酶≈（100～1000）:（100～500）:1的质量比分别配制反应液；（4）色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以体积比0.1%～1%甲酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，采用梯度洗脱，流速为0.2～0.6ml/min，柱温50～60℃，质谱检测器；（5）色谱梯度条件如下：表1流动相梯度洗脱条件(体积比)（6）测定法：取酶解样品注入液质联用仪，进行...

【专利技术属性】
技术研发人员：白海娇，韩晓捷，伏圣青，邵建强，
申请(专利权)人：天津市药品检验研究院，
类型：发明
国别省市：天津,12