粉棒束孢Defensin基因、重组蛋白及应用制造技术

本发明专利技术属于分子生物学领域，具体涉及粉棒束孢的Defensin基因、基因和重组蛋白的制备方法、重组蛋白及应用。本发明专利技术从一株具有较强杀虫活力的粉棒束孢FTRSY‑2菌株出发，首次从粉棒束孢基因组中克隆出粉棒束孢Defensin基因，命名为Ifdef，以该基因为出发点，通过分子生物学的手段构建重组载体、工程菌、重组Defensin蛋白等，并对其进行了功能验证。本发明专利技术得到的重组Defensin蛋白性质稳定，产量和纯度较高，并具有广谱杀菌效力和药理活性，有潜力开发成为生防制剂、抗菌药品、抗肿瘤药品、保健产品等。

Defensin gene, recombinant protein and its application

【技术实现步骤摘要】
粉棒束孢Defensin基因、重组蛋白及应用
本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及粉棒束孢Defensin基因、基因和重组蛋白的制备方法、重组蛋白及应用。
技术介绍
粉棒束孢(Isariafarinosa)，是丝状真菌棒束孢属(IsariaFries)模式种，是一种主要的昆虫病原真菌，同时也是一种极具开发价值和商业利用价值的真菌，具体表现在：1)现有研究表明，粉棒束孢对多种类型的害虫具有良好的杀虫效果；2)粉棒束孢作为蝙蝠蛾幼虫的定殖真菌，其药用活性也越来越多地被研究和发现；3)已从粉棒束孢培养菌丝体中分离得到包括多糖、虫草酸、生物碱、吡啶酮、天然苯腙、喹唑啉酮、环状五肽、蒽醌类化合物等多种新化合物；4)研究证明粉棒束孢菌的代谢产物中具有类似生长素和细胞分裂素的物质等。然而目前针对粉棒束孢的研究主流还停留在宏观层面上，主要以粉棒束孢的代谢产物或孢子悬液或菌丝体作为研究对象，其微观分子层面的研究才刚刚起步，且现有的利用分子生物学手段对粉棒束孢进行的深入和系统研究，主要都集中在真菌分类及作为生防菌的角度进行。申请号为201610476131.6的专利技术专利公开了一株粉棒束孢的发酵培养物在制备预防林业害虫的生防制剂中的应用，该专利技术主要是利用了菌株的发酵培养液。杨俊媛等学者从粉棒束孢培养菌丝体中分离得到多种有价值的化合物，但其研究依然停留在宏观层面。因此，有必要在全面、系统研究活性代谢产物的基础上深入开展粉棒束孢药理活性与基因功能之间的关系，以便构建出能够产生特定活性成分的超级生产菌株。鉴于此，本实验从一株具有较强杀虫活力的粉棒束孢FTRSY-2菌株出发，，本课题组发现了一条与编码真菌防御素蛋白Defensin相似的基因，并首次从粉棒束孢基因组中克隆出粉棒束孢Defensin基因，命名为Ifdef，以该基因为出发点，通过分子生物学的手段构建重组载体、工程菌、重组Defensin蛋白等，并对其进行了功能验证。为进一步研究粉棒束孢防御素基因功能奠定基础，同时为其作为潜在的广谱抗菌肽应用提供理论依据，具有重要的研究意义和潜在的商业价值。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的之一，在于提供一种粉棒束孢的Defensin基因。粉棒束孢的Defensin基因，所述的Defensin基因的核苷酸序列包括SEQIDNO.1所示和/或其中的片段。所述基因命名为Ifdef，IfdefcDNAORF全长为519bp，编码172个氨基酸，分子量约为18.4kDa本专利技术的目的之二，在于提供上述粉棒束孢Defensin基因的制备方法。上述Defensin基因的制备方法，根据粉棒束孢全基因组序列预测得到SEQIDNO.1所示序列，根据所述SEQIDNO.1序列设计若干引物对；提取粉棒束孢总RNA，反转cDNA，进行PCR扩增，获得如SEQIDNO.1所示的Defensin基因。本专利技术首次从粉棒束孢基因组中克隆出粉棒束孢Defensin基因，具有突破性的意义。进一步，所述引物对包括如序列SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示的一组引物对。所述序列SEQIDNO.2的引物命名为IfdefF；所述序列SEQIDNO.3的引物命名为IfdefR。本专利技术的目的之三，在于提供一种重组质粒载体。重组质粒载体，所述重组质粒载体包含权利要求1所述的SEQIDNO.1序列和原核表达质粒；所述SEQIDNO.1序列与原核表达质粒连接。作为一种优选，所述原核表达质粒采用SUMO-pET28a质粒。本专利技术的目的之四，在于提供一种基因工程菌。重组质粒载体转化得到的产重组Defensin蛋白的基因工程菌。进一步，所述重组Defensin蛋白在所述基因工程菌的包涵体和培养上清液中表达。所述基因工程菌由大肠杆菌BL21(DE3)制备得到。本专利技术的目的之五，在于提供一种重组Defensin蛋白。粉棒束孢的重组Defensin蛋白，所述重组Defensin蛋白的氨基酸序列包括SEQIDNO.4所示和/或其中的片段。粉棒束孢的重组Defensin蛋白，所述重组Defensin蛋白由所述的SEQIDNO.1核苷酸序列翻译得到。抗菌肽来源广泛，在哺乳动物、昆虫、鱼类、两栖动物、植物、真菌等自然界的大多数物种中存在。防御素是广泛存在于生物体中的一类内源性抗菌肽，富含半胱氨酸，具有抗细菌、真菌、病毒、肿瘤等功能。然而目前针对真菌防御素的报道不多，且多数是从具体某个菌株里分离得到，例如，从腐生子囊菌中分离出的Plectasin。因此，本专利技术通过分子生物学的手段得到粉棒束孢的重组Defensin蛋白具有突破性的意义本专利技术的目的之六，在于提供一种多克隆抗体。一种多克隆抗体，其特征在于，所述多克隆抗体包括上述的重组Defensin蛋白。本专利技术的目的之七，在于提供上述重组Defensin蛋白的一系列应用。上述重组Defensin蛋白在制备用于防治林业害虫的生防制剂中的应用。所述应用还可以由上述SEQIDNO.1的核苷酸序列和重组质粒载体得到。进一步，所述林业害虫包括油松毛虫、松梢螟、苹果蠹蛾、美国白蛾、落叶松卷蛾、黄刺蛾幼虫、板栗象甲、松墨天牛、柑桔粉蚧中的一种或多种。传统的生防制剂主要是以菌株或菌株代谢产物为基础制备，而本专利技术以重组Defensin蛋白为基础来制备，效力更强，可控性更高。上述重组Defensin蛋白在制备广谱抗菌药物中的应用。所述应用还可以由上述SEQIDNO.1的核苷酸序列和重组质粒载体得到。进一步，所述细菌包括水生拉恩氏菌(Rahnellaaquatilis)、E.persicina、普城沙雷菌(Serratiaplymuthica)、平凡假单胞菌(Pseudomonastrivialis)、菠萝泛菌(Pantoeaananatis)、土生柔特勒菌(Raoultellaterrigena)、河生肠杆菌(Lelliottiaamnigena)中的一种或多种。进一步，所述重组Defensin蛋白可以为任意药学可接受剂型，所述广谱抗菌药物还包括药学上可接受的载体和/或助剂。防御素作为一种生物体分泌的天然活性肽，抗菌谱广且作用方式独特，且相对不具有免疫原性，同时病原物也不易对其产生耐药性。目前研究报道的防御素已达30多种，但抗菌谱及抗菌能力却大有不同，推测可能是蛋白质三级结构的差异影响了其抗性谱范围及抗菌能力。本专利技术的重组Defensin蛋白三级结构预测表明活性位点存在6个半胱氨酸，但仅由一对二硫键形成β片状结构，同时含有一个α螺旋结构，与现有报道的其他防御素结构有一定差异，有望作为一种新型的抗生素替代品。上述重组Defensin蛋白在制备多克隆抗体中的应用。所述应用还可以由上述SEQIDNO.1的核苷酸序列和重组质粒载体得到。上述重组Defensin蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。所述应用还可以由上述SEQIDNO.1的核苷酸序列和重组质粒载体得到。防御素可以通过直接的细胞毒性来杀死肿瘤细胞。防御素作用于肿瘤细胞后，显微镜下观察可见肿瘤细胞足样突起回缩、细胞间隙增大、部分细胞悬浮；在透射电镜下，可见肿瘤细胞膜破裂、细胞表面绒毛消失脱落、胞核被膜破裂、甚至细胞崩解等。研究还发现，防御素可以直接诱导肿瘤细胞死亡。上述重组Defensin蛋白在制备提高人体免疫功能的保健品中的应本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.粉棒束孢的Defensin基因，其特征在于，所述的Defensin基因的核苷酸序列包括SEQ ID NO.1所示和/或其中的片段。

【技术特征摘要】
1.粉棒束孢的Defensin基因，其特征在于，所述的Defensin基因的核苷酸序列包括SEQIDNO.1所示和/或其中的片段。2.权利要求1所述的Defensin基因的制备方法，其特征在于，根据粉棒束孢全基因组序列预测得到SEQIDNO.1所示序列，根据所述SEQIDNO.1序列设计若干引物对；提取粉棒束孢总RNA，反转cDNA，进行PCR扩增，获得如SEQIDNO.1所示的Defensin基因。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述引物对包括如序列SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示的一组引物对。4.重组质粒载体，其特征在于，所述重组质粒载体包含权利要求1所述的SEQIDNO.1序列和原核表达质粒；所述SEQIDNO.1序列与原核表达质粒连接。5.重组质粒载体转化得到的产重组Defensin蛋白的基因工程菌。6.根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，所述重组Defensin蛋白在所述基因工程菌的包涵体和培养上清液中表达。7.粉棒束孢的重组Defensin蛋白，其特征在于，所述重组Defensin蛋白的氨基酸序列包括SEQIDNO.4所示和/或其中的片段。8.粉棒束孢的重组Defensin蛋白，其特征在于，所述重组Defensin蛋白由权利要求1所述的SEQIDNO.1核苷酸序列翻译得到。9.一种多克隆抗体，其特征在于，所述多克隆抗体包括权...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦少容，胡军华，卿玉玲，陈仕江，王帆，陈若霓，
申请(专利权)人：太极集团有限公司，西南大学，
类型：发明
国别省市：重庆,50