核盘菌SsMAS3基因及其在植物菌核病抗性育种中的应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，具体涉及核盘菌SsMAS3基因及其在植物菌核病抗性育种中的应用。将该基因的部分编码序列的正义序列和反义序列分别与沉默载体pCIT的内含子的两端连接形成SsMAS3的RNAi结构，将该RNAi结构接入植物表达载体得到寄主诱导表达沉默载体，该寄主诱导表达载体转染宿主后，能够产生靶向SsMAS3基因的dsRNA片段，从而在核盘菌侵染过程中诱发SsMAS3基因的沉默，显著增加宿主的核盘菌抗性。使得该基因及采用该基因构建的寄主诱导沉默表达载体在植物菌核病抗性育种具有巨大的应用前景。

SsMAS3 Gene of Sclerotinia sclerotiorum and Its Application in Plant Sclerotinia Resistance Breeding

【技术实现步骤摘要】
核盘菌SsMAS3基因及其在植物菌核病抗性育种中的应用
本专利技术属于基因工程
，具体涉及核盘菌SsMAS3基因及其在植物菌核病抗性育种中的应用。
技术介绍
由核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum(Lib.)deBary)导致的菌核病不仅是模式植物拟南芥的一种病害，也是危害我国很多重要农作物生产的重要病害之一，比如该病害每年导致油菜10～30％的产量损失，严重时减产80％(吴健等2013)，并且导致种子含油量和品质降低。在核盘菌的侵染过程中，菌核可以直接萌发成菌丝，侵染植物；或者是通过萌发子囊盘，产生子囊孢子萌发形成菌丝，从而侵染植物。菌丝在入侵到植物组织前，首先在寄主表面扩展，形成侵染垫或附着胞，渗透健康的植物表皮，而菌丝则产生更多的分枝(Amselem，2011；LiangandRollins，2018)。随后，核盘菌通过合成、分泌多种水解酶及毒素草酸攻破寄主表层防护、降解细胞壁、浸软和致死寄主组织，为病菌提供营养，便于菌丝进一步入侵和增殖(Bashietal.2012；Kimetal.2008；Seifbarghietal.2017)。因此，如果菌丝生长、或侵染垫形成受阻，菌核病可以有效控制。目前，防治油菜抗菌核病主要有如下途径：农药与生物防治、选育抗(耐)菌核病材料、基因工程方法。通过这些途径，取得了一些成绩，筛选到一些抗(耐)病性比较好的材料，但是生产中菌核病危害严重的问题依然存在(刘正立,刘春林.甘蓝型油菜抗菌核病研究进展.中国农学通报,2015,31(15):114-123)。专利文献CN106397555A和CN106518992A分别公开了核盘菌凝集素SSL-6蛋白和核盘菌异核体不亲和YD-7蛋白，通过构建蛋白编码基因的过表达质粒，并转入宿主植物中，获得具有抗菌核病的植物种质资源。
技术实现思路
为减少核盘菌对植株侵害，本专利技术提供一种影响核盘菌菌丝生长和侵染垫形成的核盘菌SsMAS3基因，该基因的部分编码序列的正义序列和反义序列分别与沉默载体pCIT的内含子的两端连接形成SsMAS3的RNAi结构，将该RNAi结构接入植物表达载体得到寄主诱导表达沉默载体，该寄主诱导表达载体转染宿主后，能够产生靶向SsMAS3基因的dsRNA片段，从而在核盘菌侵染过程中诱发SsMAS3基因的沉默，显著增加宿主的核盘菌抗性。核盘菌SsMAS3基因，其编码氨基酸序列如SEQIDNo.1所示的蛋白；优选的，所述核盘菌SsMAS3基因的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。上述核盘菌SsMAS3基因在构建沉默SsMAS3基因的寄主诱导表达沉默载体中应用也属于本专利技术的保护范围。本专利技术还提供了沉默SsMAS3基因的寄主诱导沉默表达载体的构建方法，该方法包括以下步骤：克隆SsMAS3基因的部分编码序列，将其正义序列和反义序列分别与SEQIDNo.3所示核苷酸序列的两端相连得到SsMAS3基因的RNAi(RNA干扰，RNAinterference)结构，将所述RNAi结构接入植物表达载体的启动子和终止子之间得到所述寄主诱导沉默表达载体。上述SsMAS3基因的部分编码序列，是SsMAS3基因的保守序列的一段核苷酸序列，长度为300-500bp之间，所述正义和反义序列分别连接到内含子两端，在植物中转录后形成发卡结构，产生SsMAS3基因的dsRNA片段，该dsRNA被识别后即被核酸内切酶(RNAseⅢ)切割成长度为21～35个核苷酸的RNA片段(siRNA)。双链siRNA在RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，继之由反义siRNA再与体内一些酶(包括内切酶、外切酶、螺旋酶)或蛋白结合，形成RNA诱导沉默复合体(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)。在ATP存在的情况下，被激活的RISC以单链siRNA作为向导，通过碱基互补配对原则，以序列特异性的方式引导Argonaute蛋白与靶标分子结合去寻找与之互补的靶基因SsMAS3。SsMAS3的mRNA分子被Argonaute蛋白识别之后会被切割或者抑制翻译，最终被细胞降解。优选的，所述沉默SsMAS3基因的寄主诱导沉默表达载体的构建方法，包括以下具体步骤：(1)克隆SsMAS3基因的部分编码序列，将其正义序列和反义序列分别连入载体pCIT的内含子两端，构建沉默表达载体pSimas3，所述正义序列、pCIT的内含子(SEQIDNo.3)和反义序列连接形成的核苷酸片段为SsMAS3基因的RNAi结构；(2)将SsMAS3基因的沉默表达载体中的RNAi结构连入植物表达载体的启动子和终止子之间，得到所述寄主诱导沉默表达载体。上述载体pCIT(Yuetal.2012,PLoSOne,7,e34962)，包含来源于Aspergillusnidulans的trpC基因的启动子PtrpC及终止子TtrpC，以及来源于Gibberellazeae的EAA75655.1基因的402bp的内含子片段(SEQIDNo.3)。优选的，所述沉默表达载体pSimas3中含有潮霉素(Hyg)和氨苄青霉素(Amp)抗性元件。其中筛选标记潮霉素(Hyg)可以用遗传霉素(G418)代替。优选的，所述植物表达载体为pBinGlyRed3，含有种子特异型的Glycinin启动子和Gly-term终止子的载体，所述Glycinin启动子可以用CaMV35S启动子代替，Gly-term终止子可以用NOS终止子代替。所述植物表达载体的具体结构参见“叶绿素合成酶基因在甘蓝型油菜及拟南芥种子生育酚合成过程中的作用研究，周元委，2017，硕士学位论文)”。优选的，所述SsMAS3基因的RNAi结构通过多克隆位点插入所述Glycinin启动子和所述Gly-term终止子之间，所述多克隆位点具体为EcoRI、XbaI、XmaI、SmaI和XhoI。优选的，所述植物表达中还含有卡那霉素(Kana)抗性元件，同时包含一个红色荧光蛋白(DsRed)的筛选标记，DsRed的启动子为CMV启动子，终止子为Nos终止子。所述红色荧光蛋白筛选标记可以由潮霉素(Hyg)抗性元件代替。上述构建方法构建的寄主诱导沉默表达载体，经浸花法(Flowerdip)转化拟南芥，菌核病抗性鉴定表明，活体接种的转基因拟南芥的菌斑面积相比对照显著减小了53％-71％。因此，上述构建方法构建的寄主诱导沉默载体属于本专利技术的保护范围。上述构建方法制备的寄主诱导沉默表达载体和上述核盘菌SsMAS3基因在植物菌核病抗性育种中的应用也属于本专利技术的保护范围。优选的，所述植物菌核病抗性育种是指十字花科植物菌核病抗性育种。本专利技术还提供上述寄主诱导沉默表达载体在植物菌核病抗性育种中的应用方法，采用寄主诱导沉默表达载体转化农杆菌，农杆菌浸花法转化植物的花序得转化后的花序，将植物培养至种子成熟，利用基因标记挑选转化成功的植株。本专利技术的有益效果在于：1.本专利技术提供了专利技术提供了核盘菌SsMAS3基因的基因组及蛋白序列，该基因影响核盘菌菌丝生长、侵染垫形成，在核盘菌致病过程中起着重要作用；2.本专利技术的构建方法构建的寄主诱导沉默表达载体，将其转化十字花科植物后，T0代收获的种子长成的植株(T1代)具有菌核病抗性，且可被遗传至后代，其在十本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.核盘菌SsMAS3基因，其编码氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的蛋白。

【技术特征摘要】
1.核盘菌SsMAS3基因，其编码氨基酸序列如SEQIDNo.1所示的蛋白。2.根据权利要求1所述的核盘菌SsMAS3基因，其特征在于，所述核盘菌SsMAS3基因的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。3.权利要求1或2所述的核盘菌SsMAS3基因在构建沉默SsMAS3基因的寄主诱导表达沉默载体中应用。4.沉默SsMAS3基因的寄主诱导沉默表达载体的构建方法，该构建方法包括以下步骤：克隆如权利要求1或2所述的核盘菌SsMAS3基因的部分编码序列，将其正义序列和反义序列分别与SEQIDNo.3所示核苷酸序列的两端相连得到SsMAS3基因的RNAi结构，将所述RNAi结构接入植物表达载体的启动子和终止子之间得到所述寄主诱导沉默表达载体。5.根据权利要求4所述的构建方法，所述构建方法，包括以下具体步骤：(1)克隆SsMAS3基因的部分编码序列，将其正义序列和反义序列分别连入载体pCIT的内含子两端，构建沉默表达载体pSimas3，所述正义序列、pCIT的内含子和反义序列连接形成的核苷酸片段为SsMAS3基因的RNAi结构；(2)将SsMAS3基因的沉默表达载体中的RNAi结构连入植物表达载体的启动子和终止子之间，得到所述寄主诱导沉默表达载体。6....

【专利技术属性】
技术研发人员：丁一娟，钱伟，柴亚茹，申浩晶，杨文静，闫宝琴，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：重庆,50