一株过表达分解代谢物控制蛋白A编码基因的工程菌及其构建方法技术

一株过表达分解代谢物控制蛋白A编码基因的工程菌及其构建方法。过表达分解代谢物控制蛋白A编码基因ccpA利用PCR扩增克隆多糖絮凝剂合成途径获得，核苷酸序列如SEQ ID No1。将ccpA基因片段连接到表达载体上，导入地衣芽孢杆菌中，通过四环素抗性筛选获得目的基因的一株过表达分解代谢物控制蛋白A编码基因ccpA的地衣芽孢杆菌基因工程菌。构建方法：设计PCR引物；将扩增得到的目的基因插入到PHY300PLK‑PamyL‑TTamyL组成型启动子PamyL下游多克隆位点得过表达质粒，导入E.coli DH5α中扩增；将过表达质粒电转化地衣芽孢杆菌，筛选转化子，经验证得地衣芽孢杆菌重组菌。

【技术实现步骤摘要】
一株过表达分解代谢物控制蛋白A编码基因的工程菌及其构建方法
本专利技术涉及基因工程及微生物发酵工程领域，尤其是涉及一株过表达分解代谢物控制蛋白A编码基因的工程菌及其构建方法。
技术介绍
细菌在多种碳源共存的环境中优先利用一种(通常是葡萄糖)的现象被称为分解代谢产物阻遏效应(CCR)。CcpA是细胞中碳代谢的中心调控蛋白，在微生物胞内CcpA参与许多代谢调控过程(Bioscience,biotechnology,andbiochemistry,2009,73(2):245-259)：(1)激活氨基酸代谢(ilv-len)操纵子；(2)抑制许多与碳代谢、氮代谢和磷代谢相关的蛋白的表达；(3)含PTS系统的低GC含量革兰氏阳性菌大部分可能以CcpA依赖的CCR效应进行碳源次序代谢的调控；(4)B.subtilis和B.licheniformis在一些压力环境中生长时，通过上调CcpA的表达量来适应外界极端环境(Proteomics,2006,6(16):4565-4585；Proteomics,2007,7(3):413-423)。CcpA通过调节胞内新陈代谢使菌体碳代谢和能量利用率最大化，从而促进菌体生长(MicrobialBiotechnology,2014,7(5):446-455)。当Glu存在时，CcpA能激活糖酵解途径而抑制三羧酸循环，加快菌体生长。文献报道，在地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌中CcpA可以通过激活谷氨酸合成酶和抑制谷氨酸脱氢酶调控谷氨酸的合成，促进γ-PGA的合成(BiotechnologyandBioengineering,2016,113(4):797-806；JournalofBacteriology,2004,186(11):3392-3398)，敲除CcpA基因则会影响多糖的分泌。同时CcpA调控两种胞外聚合物的转换，当葡萄糖存在时，CcpA激活一系列与多糖合成相关的操纵子，促进合成多糖，葡萄糖耗尽后，CcpA则促进γ-PGA的合成。因此，CcpA的表达能够促进菌体的生长，同时能够调控γ-PGA和多糖的生物合成以及两者之间的转换。生物絮凝剂是一种新型絮凝剂，由真菌和细菌等微生物产生，与传统絮凝剂相比，易被生物降解，无毒，无二次污染。组成的絮凝物质主要是多糖，多肽，蛋白质，脂类和核酸(AppliedMicrobiologyandBiotechnology,1998,50(6):682-691)。其中，多糖和多肽(γ-PGA)是目前研究报告中最常见的两种微生物絮凝物质(CarbohydratePolymers,2011,84(1):454-458)。γ-PGA作为絮凝活性物质在食品、发酵、水处理、制糖工业和微藻收集等领域具有广阔的应用前景(MolecularMicrobiology,2005,57(3):717-726；BiotechnologyAdvances,2018,36,1424–1433)。多糖絮凝剂也广泛应用于去除工业废水中的色素、悬浮物和重金属离子(Pb2+，Cd2+，Zn2+)(ColloidsandSurfacesB-Biointerfaces,2005,44(4):179-186.；BioresourceTechnology,2007,98(2):361-367.)以及对高岭土溶液(BiotechnologyLetters,1996,18(12):1459-1464；BioresourceTechnology,2018,255,171–179)和微观小球藻(ScienceofTheTotalEnvironment,2018,634:488-496)的絮凝。然而，低产率，低絮凝活性和高价格等因素限制了生物絮凝剂的规模和产业化，以往，大部分关于生物絮凝剂的报道多指向培养基、生长条件的优化和应用领域(ProcessBiochemistry,2014,49(4:576-582)，关于地衣芽孢杆菌的遗传和代谢途径对絮凝剂合成的调控的报道比较少。对于芽孢杆菌在合成多糖和γ-PGA两种絮凝活性物质的代谢途径的了解不够深入(BiotechnologyAdvances,2018,36,1424–1433)，不利于对该菌的代谢进行调控，因此，通过基因工程改造得到高产优良菌株提高，进一步提高生物絮凝剂活性，同时为絮凝活性物质成分代谢的研究奠定基础，具有重要的经济价值及社会意义。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于针对现有技术中生物絮凝剂絮凝活性不高、调控机理不明等问题，提供过表达分解代谢物控制蛋白A编码基因(ccpA)。本专利技术的第二目的在于提供一株过表达分解代谢物控制蛋白A编码基因ccpA的地衣芽孢杆菌基因工程菌。本专利技术的第三目的在于提供过表达分解代谢物控制蛋白A编码基因ccpA的工程菌的构建方法。本专利技术的第四目的在于提供过表达分解代谢物控制蛋白A编码基因ccpA的工程菌在制备多糖絮凝剂中的应用。所述过表达分解代谢物控制蛋白A编码基因ccpA利用PCR扩增克隆多糖絮凝剂合成途径获得，ccpA基因的核苷酸序列如序列表中SEQIDNo：1所示。将ccpA基因片段连接到表达载体上，然后利用电转化的方法导入到地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)中，通过四环素抗性筛选获得目的基因的一株过表达分解代谢物控制蛋白A编码基因ccpA的地衣芽孢杆菌基因工程菌。所述表达载体为游离载体，优选的所述表达载体为本实验室构建的表达载体PHY300PLK-PamyL-TTamyL。所述表达载体的启动子为地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)α-淀粉酶基因的启动子PamyL。所述地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)为实验室自主筛选的菌株地衣芽孢杆菌(BacilluslicheniformisCGMCC2876)，所述地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)已于2009年01月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCCNo.2876(参见中国专利CN200910111262.4，专利名称为利用地衣芽孢杆菌制备生物絮凝剂的方法)。所述过表达分解代谢物控制蛋白A编码基因ccpA的工程菌的构建方法，包括以下步骤：1)设计分解代谢物控制蛋白A编码基因ccpA的PCR引物；2)将扩增得到的目的基因插入到PHY300PLK-PamyL-TTamyL组成型启动子PamyL下游多克隆位点，得到PHY300－ccpA过表达质粒；3)将PHY300－ccpA过表达质粒导入到E.coliDH5α中扩增；4)将经提取、浓缩后的PHY300－ccpA过表达质粒电转化地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)，37℃复苏5h，于四环素抗性LB固体培养基上涂布，在37℃培养12h，筛选转化子；5)转化子经质粒提取后，通过菌落PCR和双酶切进行验证，从而获得过表达分解代谢物控制蛋白A编码基因的地衣芽孢杆菌重组菌HN301-8。所述一株过表达分解代谢物控制蛋白A编码基因ccpA的地衣芽孢杆菌基因工程菌在制备多糖絮凝剂中应用。所述一株过表达分解代谢物控制蛋白A编码基因ccpA的地衣芽孢杆菌基因工程菌在本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.过表达分解代谢物控制蛋白A编码基因ccpA，其特征在于利用PCR扩增克隆多糖絮凝剂合成途径获得，ccpA基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No：1所示。

【技术特征摘要】
1.过表达分解代谢物控制蛋白A编码基因ccpA，其特征在于利用PCR扩增克隆多糖絮凝剂合成途径获得，ccpA基因的核苷酸序列如序列表中SEQIDNo：1所示。2.一株过表达分解代谢物控制蛋白A编码基因ccpA的地衣芽孢杆菌基因工程菌，其特征在于将ccpA基因片段连接到表达载体上，然后利用电转化的方法导入到地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)中，通过四环素抗性筛选获得目的基因的一株过表达分解代谢物控制蛋白A编码基因ccpA的地衣芽孢杆菌基因工程菌。3.如权利要求2所述一株过表达分解代谢物控制蛋白A编码基因ccpA的地衣芽孢杆菌基因工程菌，其特征在于所述表达载体为游离载体。4.如权利要求3所述一株过表达分解代谢物控制蛋白A编码基因ccpA的地衣芽孢杆菌基因工程菌，其特征在于所述表达载体为表达载体PHY300PLK-PamyL-TTamyL。5.如权利要求3所述一株过表达分解代谢物控制蛋白A编码基因ccpA的地衣芽孢杆菌基因工程菌，其特征在于所述表达载体的启动子为地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)α-淀粉酶基因的启动子PamyL。6.如权利要求5所述一株过表达分解代谢物控制蛋白A编码基因ccpA的地衣芽孢杆菌基因工程菌，其特征在于所述地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)已于2009年01月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCCNo.2876。7.如权利要求2所述过表达分解代谢物控制蛋白A编码基因ccpA的工程菌的构建方法，其特征在于包括以下步骤：1)设计分解代谢物控制蛋白A编码基因ccpA的...

【专利技术属性】
技术研发人员：何宁，王玲伟，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：福建,35