与布鲁氏菌毒力相关的基因及其在布鲁氏菌毒力评价以及制备弱毒布鲁氏菌中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种与布鲁氏菌毒力相关的基因及其在布鲁氏菌毒力评价以及制备弱毒布鲁氏菌中的应用。本发明专利技术利用同源重组的方法，以卡那霉素基因替换布鲁氏菌M28核糖体基因L31，构建了布鲁氏菌L31基因缺失株M28ΔL31。利用巨噬细胞RAW264.7和Babl/c小鼠模型评价了布鲁氏菌L31基因对布鲁氏菌M28毒力的影响。结果显示：L31基因缺失后并不会对M28的生长产生影响，但能显著下调强毒株M28在鼠巨噬细胞系RAW264.7和小鼠脾脏内复制生存的能力，M28ΔL31中将L31基因回补后其毒力能够恢复到野生株水平，证实该基因是布鲁氏菌M28的毒力相关基因。本发明专利技术的提出预示该毒力基因可能用于布鲁氏菌新疫苗的研发，具有潜在的应用价值。

Virulence-related genes of Brucella and their application in virulence evaluation of Brucella and preparation of attenuated Brucella

The invention discloses a gene related to the virulence of Brucella and its application in the virulence evaluation of Brucella and the preparation of attenuated Brucella. The present invention uses homologous recombination method to replace Brucella M28 ribosomal gene L31 with kanamycin gene, and constructs Brucella L31 gene deletion strain M28 L31. The effects of Brucella L31 gene on the virulence of Brucella M28 were evaluated using RAW264.7 macrophage and Babl/c mouse models. The results showed that the deletion of L31 gene did not affect the growth of M28, but significantly reduced the replication and survival ability of M28 in mouse macrophage line RAW264.7 and mouse spleen. The virulence of L31 gene in M28 L31 could be restored to the level of wild strain after replenishing, which confirmed that it was a virulence-related gene of Brucella M28. The present invention indicates that the virulence gene may be used in the development of new Brucella vaccine and has potential application value.

【技术实现步骤摘要】
与布鲁氏菌毒力相关的基因及其在布鲁氏菌毒力评价以及制备弱毒布鲁氏菌中的应用
本专利技术涉及布鲁氏菌的一种新型毒力基因，还涉及该毒力基因在布鲁氏菌毒力评价以及制备弱毒布鲁氏菌中的应用。本专利技术属于生物

技术介绍
布鲁氏菌(Brucella)是一种重要的人兽共患病菌，可感染人和多种动物，其引起的疾病称为布鲁氏菌病。人感染布病后会出现关节痛、肌肉痛、波浪热等症状，部分患者可能出现脾肿大或淋巴结肿大、附睾炎和睾丸炎等。家畜感染后会引起公畜睾丸肿大、母畜流产等生殖系统疾病。该病流行范围广泛，几乎遍布世界各地。我国目前主要依靠减毒活疫苗预防该病，如羊种M5-90、牛种S19和猪种S2等。但这类疫苗仍存在毒力较强、可能引起动物流产及对人致病等缺点。为此，寻找新的毒力基因，用于致弱布鲁氏菌毒力有着重要的理论与实践意义。布鲁氏菌被认为是没有典型毒力因子的病原，其毒力主要依赖于其逃避宿主免疫应答并在宿主细胞内持续存活的能力。巨噬细胞、胎盘滋养层细胞和树突状细胞是布鲁氏菌在宿主内存活复制的主要细胞。在布鲁氏菌内化感染的过程中，一些因子发挥着关键的作用，如四型分泌系统(T4SS)、双组分调控系统(TCS)、脂多糖(LPS)和类鞭毛基因等。此外，一些参与金属元素代谢调控的基因也会影响布鲁氏菌的毒力，如缺失ZnuA基因使布鲁氏菌营养成分的摄取能力减弱进而下调细菌毒力。核糖体蛋白由于需要参与核糖体的装配和功能发挥通常是非常保守的。目前布鲁氏菌中研究较多的核糖体蛋白是L7/L12。有研究报道使用大肠杆菌(E.coli)脂质体(Lipidliposome)包裹递送L7/L12重组蛋白为基础免疫小鼠能诱导产生细胞免疫，分泌特异性抗体，产生保护性免疫应答。到目前为止尚未有布鲁氏菌核糖体蛋白L31的相关研究报道。相关研究显示在枯草芽孢杆菌中核糖体蛋白L31与锌元素平衡有关，是核糖体的非必须组成部分，其储存锌的功能大于作为核糖体的组成部分。本专利技术首次证实发现核糖体基因L31与布鲁氏菌毒力相关，对于布鲁氏菌新疫苗的研发，具有潜在的应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种新型的与布鲁氏菌毒力相关的基因及其用途。本专利技术的目的之二在于提供一种布鲁氏菌毒力基因检测试剂盒。本专利技术的目的之三在于提供一种致弱的布鲁氏菌及其构建方法。为了达到上述目的，本专利技术采用了以下技术手段：一种与布鲁氏菌毒力相关的基因，所述的基因为编码布鲁氏菌核糖体蛋白L31的基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。进一步的，本专利技术还提出了所述的与布鲁氏菌毒力相关的基因在布鲁氏菌毒力评价中的应用。以及所述的与布鲁氏菌毒力相关的基因在制备弱毒布鲁氏菌中的应用。更进一步的，本专利技术还提出了一种布鲁氏菌毒力基因检测试剂盒，含有用于扩增编码布鲁氏菌核糖体蛋白L31的基因的引物以及PCR试剂，所述的基因为编码布鲁氏菌核糖体蛋白L31的基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。其中，优选的，所述的引物由上游引物和下游引物组成，上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.10所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.11所示。再进一步的，本专利技术还提出了一种致弱的布鲁氏菌所述的布鲁氏菌的基因组中不含有编码布鲁氏菌核糖体蛋白L31的基因。其中，优选的，所述的致弱的布鲁氏菌通过以下方法制备得到：(1)合成用于构建布鲁氏菌L31基因缺失株的引物：L31_L-F：5’GGTGACACTATAGAACTCGAGAAACCGTGATCGATCATGCG3’L31_L-R：5’GAACTTCTCAATCCTGAAAGTCTGGGG3’L31_K-F：5’CTTTCAGGATTGAGAAGTTCAAATATGTATCCGCTCATGAGA3’L31_K-R：5’TCGGATCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGC3’L31_R-F：5’GACGAGTTCTTCTGATCCGAATTGCATCTGATTTGAA3’L31_R-R：5’TATAGGGAGACCGGCAGATCTGGCGCCGAAGACGTGCAG3’L31Yan_F：5’ATCACAAAGAAATAACGCAGGCCCG3’L31Yan_R：5’CTCGGTTTCCTTCATGTTCGATCGC3’(2)自杀质粒的构建以布鲁氏菌基因组DNA为模板，使用引物L31_L-F、L31_L-R和L31_R-F、L31_R-R分别PCR扩增L31基因N端、C端同源臂；以pBlue-Kanr为模板，使用引物L31_K-F和L31_K-R扩增Kanr表达盒；用XhoI和BglⅡ双酶切pSP72载体，切胶回收以上三段目的片段，连接产物转化至感受态细胞中，涂布Kanr抗性平板，筛选阳性克隆，得到的阳性克隆命名为pSP72-ΔL31-k；(3)自杀质粒的电击转化及L31基因缺失株的鉴定筛选将pSP72-ΔL31-k电转入布鲁氏菌感受态细胞中，筛选获得只有卡那抗性阳性克隆，对筛选到的候选缺失株划线传代，检测其稳定性，利用引物L31Yan_F和L31Yan_R完成PCR鉴定，并进一步测序鉴定，选取阳性菌株扩大培养后保存，得到致弱的布鲁氏菌，命名为M28ΔL31。相较于现有技术，本专利技术的有益效果是：布鲁氏菌被认为是没有典型毒力因子的病原，其毒力主要依赖于其逃避宿主免疫应答并在宿主细胞内持续存活的能力。本专利技术提出了一种新型的与布鲁氏菌毒力相关的基因，通过敲除该基因构建了布鲁氏菌L31基因缺失株M28ΔL31，实验证明L31基因不会对布鲁氏菌的生长造成显著影响，属生长非必须基因。缺失株M28ΔL31与野生株相比，宿主细胞内存活能力在感染8h和24h无显著性下降，但在感染48h时缺失株胞内存活能力极显著下降。感染小鼠7d时，M28和M28ΔL31感染小鼠的脾重均呈相似的上升趋势。在感染后21d和35d时M28ΔL31感染小鼠脾重与野生株相比均呈极显著下降。M28ΔL31所感染小鼠与M28感染小鼠相比除21d时(P<0.05)显著下降，在感染后3d、7d和35d脾脏载菌量均呈极显著下降(P<0.01)，证明布鲁氏菌L31基因与布鲁氏菌的毒力相关。通过对该基因的检测，能够对布鲁氏菌的毒力进行评价，并且通过敲除该基因或降低该基因的表达水平能够制备得到毒力显著下降的布鲁氏菌，本专利技术的提出为布鲁氏菌新疫苗的研发提供了新的技术手段。附图说明图1为自杀质粒与回补质粒的构建与鉴定；(A)pSP72-ΔL31-k质粒的构建与鉴定：M：DNAMarkerDL5000，1-3：L31左同源臂、kan基因、L31右同源臂；4：重组质粒pSP72-ΔL31-k的PCR扩增鉴定；(B)PCR扩增鉴定质粒pBBR1MCS4-L31：M：DNAMarkerDL5000，1：重组质粒pBBR1MCS4-L31的PCR扩增鉴定；图2为M28ΔL31缺失株与M28ΔL31-c回补株的PCR鉴定；(A)M28ΔL31缺失株PCR鉴定：M：DNAMarkerDL5000，1：M28ΔL31，2：M28；(B)M28ΔL31-c回补株PCR鉴定：M：DNAMarkerDL5000，1：M28ΔL31，2：M28ΔL31-c；图3为M28和M28ΔL31的生长曲线测定；图4为L31影响布鲁氏本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.与布鲁氏菌毒力相关的基因，其特征在于，所述的基因为编码布鲁氏菌核糖体蛋白L31的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.与布鲁氏菌毒力相关的基因，其特征在于，所述的基因为编码布鲁氏菌核糖体蛋白L31的基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.权利要求1所述的与布鲁氏菌毒力相关的基因在布鲁氏菌毒力评价中的应用。3.权利要求1所述的与布鲁氏菌毒力相关的基因在制备弱毒布鲁氏菌中的应用。4.一种布鲁氏菌毒力基因检测试剂盒，其特征在于，含有用于扩增编码布鲁氏菌核糖体蛋白L31的基因的引物以及PCR试剂，所述的基因为编码布鲁氏菌核糖体蛋白L31的基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的引物由上游引物和下游引物组成，上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.10所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.11所示。6.一种致弱的布鲁氏菌，其特征在于，所述的布鲁氏菌的基因组中不含有编码布鲁氏菌核糖体蛋白L31的基因。7.如权利要求6所述的致弱的布鲁氏菌，其特征在于，通过以下方法制备得到：(1)合成用于构建布鲁氏菌L31基因缺失株的引物：L31_L-F：5’GGTGACACTATAGAACTCGAGAAACCGTGATCGATCATGCG3’L31_L-R：5’GAACTTCTCAATCCTGAAAGTCTGGGG3’L31_K-F：5’CTTTCAGGATTGAGAAGTTCAAATATGTATCCGCTCATGAGA3’L31_K...

【专利技术属性】
技术研发人员：步志高，胡森，许达，
申请(专利权)人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23