一种游动球菌耐盐碱基因mceT及其鉴定方法技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，公开了一种游动球菌耐盐碱基因mceT及其鉴定方法，耐盐碱基因mceT，含一个921bp的完整开放阅读框ORF；从德昌游动球菌中获得含有耐盐碱相关的基因片段；构建含有游动球菌耐盐碱基因mceT基因的原核表达载体；通过化转异源宿主将携带基因mceT的质粒电击转化的方法导入至KNabc宿主中，对基因mceT生理功能及编码的蛋白活性进行鉴定。本发明专利技术能够抑制一株Zn

【技术实现步骤摘要】
一种游动球菌耐盐碱基因mceT及其鉴定方法
本专利技术属于基因工程
，尤其涉及一种游动球菌耐盐碱基因mceT及其鉴定方法。
技术介绍
目前，业内常用的现有技术是这样的：目前认为实现盐碱地土壤改良需要多学科共同攻关才能得以完成。从生物学角度，主要的方法则是从微生物和植物同时入手，高效耐盐微生物与植物协同作用。现有表明固氮菌、根瘤菌等微生物肥料的施用与化学肥料相比，在促进高效耐盐碱植物改良盐碱地土壤方面，效果更加明显。但很多植物无法直接获得盐碱地贫瘠的碳氮源，且只施用化学肥料则会造成更严重的环境灾难。可用于土壤改良的微生物肥料和植物却不具有抵抗高盐碱的能力，这成了目前技术的难题。因此，除了发掘高效耐盐碱的微生物和植物资源以外，规模化地发掘高效耐盐碱的新功能基因用以构建相应基因工程菌株微生物肥料和转基因植物显得尤为重要。Na+/H+逆向转运蛋白是能够利用跨膜质子梯度势将细胞内Na+排出到细胞外的一类次级转运蛋白，是生物维持体内Na+和pH稳态的主要蛋白。由于Na+/H+逆向转运蛋白同时具有Li+/H+逆向转运蛋白活性，它们也被称为Na+(Li+)/H+逆向转运蛋白。其中有些报道显示出同时具有K+/H+逆向转运蛋白。根据其蛋白结构的不同，Na+/H+逆向转运蛋白分为NhaA、NhaB、NhaC、NhaD、NhaE、CPA1、CPA2、CPA3和DHA1这9大家族。其中除CPA3家族由多个基因组成以外，其余都是单个基因编码的蛋白。Na+/H+逆向转运蛋白是微生物以及植物抵抗盐碱胁迫的一类重要蛋白，但是目前已知的的Na+/H+逆向转运蛋白种类有限，功能单一，且应用较少。综上所述，现有技术存在的问题是：现有技术中很多根际促生微生物和植物无法直接在盐碱地土壤上正常生长，且物理化学方法对土壤改造存在着环境污染的潜在问题。现有技术中Na+/H+逆向转运蛋白是微生物以及植物抵抗盐碱胁迫的一类重要蛋白，目前已知的的Na+/H+逆向转运蛋白种类有限，功能单一，且应用较少。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种游动球菌耐盐碱基因mceT及其鉴定方法。本专利技术是这样实现的，一种游动球菌耐盐碱基因mceT，所述的游动球菌耐盐碱基因mceT，含一个921bp的完整开放阅读框ORF，ORF的核苷酸序列为SEQIDNO.1。本专利技术的另一目的在于提供一种利用所述游动球菌耐盐碱基因mceT编码的蛋白，所述的蛋白氨基酸序列为SEQIDNO.2。进一步，所述蛋白具有Na+(Li+、K+)/H+逆向转运蛋白活性，且Na+(Li+、K+)/H+逆向转运蛋白活性具有pH依赖性。进一步，所述蛋白具有促进Zn2+吸收转运能力。本专利技术的另一目的在于提供一种所述游动球菌耐盐碱基因mceT的鉴定方法包括以下步骤：(1)通过基因文库与基因功能互补相结合的筛选技术，从游动球菌中获得含有耐盐碱相关的基因片段，所述的耐盐碱相关的基因片段中含有一个长921bp的mceT基因的完整开放阅读框ORF，ORF的核苷酸序列如SEQIDNO.1。(2)构建含有游动球菌耐盐碱基因mceT基因的原核表达载体；(3)通过化转异源宿主EscherichiacoliKNabc，将携带基因mceT的质粒电击转化的方法导入至KNabc宿主中，对基因mceT生理功能及编码的蛋白活性进行鉴定。本专利技术的另一目的在于提供一种利用所述游动球菌耐盐碱基因mceT构建的原核表达载体，所述原核表达载体为pTrcHisB-mceT。本专利技术的另一目的在于提供一种原核表达载体的构建方法包括：根据mceT基因序列，首先设计引物，并在基因的5’和3’端分别引入BamHI和HindIII两个酶切位点，然后进行mceT基因的PCR扩增，对mceT基因进行亚克隆；将PCR扩增产物酶切纯化后连接到表达载体pTrcHisB上，化转到KNabc感受态细胞中，将转化产物进行蓝白斑筛选；对得到的转化子进行测序。本专利技术的另一目的在于提供一种利用所述游动球菌耐盐碱基因mceT制备的开发微生物肥料。本专利技术的另一目的在于提供一种利用所述游动球菌耐盐碱基因mceT表达的失去耐盐功能突变体，所述失去耐盐功能突变体只具有促进Zn2+吸收能力，氨基酸定点突变体为Q150A、S158A。本专利技术的另一目的在于提供一种利用所述游动球菌耐盐碱基因mceT表达的失去促进Zn2+吸收能力突变体，所述失去促进Zn2+吸收能力突变体只具有耐盐功能的氨基酸定点突变体D41A、D154A。综上所述，本专利技术的优点及积极效果为：本专利技术提供了一种德昌游动球菌新型Na+/H+逆向转运蛋白基因mceT及其鉴定方法。MceT蛋白根据其序列和结构相似性属于阳离子扩散促进家族(CationDiffusionFacilitatorFamily)，所有已鉴定的这一家族蛋白都是只具有二价阳离子(Me2+)外排转运功能，而专利技术发现的MceT蛋白具有单价阳离子(Me+)外排转运功能，能够有效的提高一株盐碱敏感型大肠杆菌突变株KNabc的盐碱抗性；MceT蛋白同时具有促进Zn2+向细胞内扩散的功能，能够抑制一株Zn2+敏感型大肠杆菌突变株在含0.75mMZnCl2的培养基中的生长。并且构建了MceT蛋白的多种突变体，使其只能行使耐盐碱或促进Zn2+向细胞内扩散的其中一种功能。类似松嫩平原盐碱地的碳酸盐型盐碱地具有高盐浓度，高pH值，低Zn2+浓度的特点。本专利技术的功能将有效提高有机体的耐盐碱能力和Zn2+摄取能力。附图说明图1是本专利技术实施例提供的NEAU-ST10-9总基因组部分酶切结果电泳图。图中：第1-9泳道使用的酶量依次为：4.950U，2.475U，1.2375U，0.61875U，0.30937U，0.15468U，0.07734U，0.03867U，0U。M：1kbDNALadde。图2是本专利技术实施例提供的载体pUC18的完全酶切结果电泳图。图中：M:Trans2KPlusIIDNAMarker；1:pUC18质粒；2:pUC18质粒BamHI完全酶切产物。图3是本专利技术实施例提供的pUC-S5目的片段序列分析图。图4是本专利技术实施例提供的MceT蛋白耐盐碱生理活性测定图。图中：黑色柱为KNabc/pTrcHisB-mceT，白色柱为KNabc/pTrcHisB。图5是本专利技术实施例提供的MceT蛋白Na+(Li+、K+)/H+逆向转运活性的测定图。图中：(a)、(b)、(c)为在pH8.0条件下反转膜活性测试图，图左为KNabc/pTrcHisB的反转膜活性测试，图右为KNabc/pTrcHisB的反转膜活性；(d)图为KNabc/pTrcHisB-mceT在不同pH缓冲液中计算后反转膜活性值。图6是本专利技术实施例提供的MceT蛋白促进Zn2+吸收生理活性测定图。图7是本专利技术实施例提供的MceT蛋白促进Zn2+吸收原子吸收实验测定图。图8是本专利技术实施例提供的MceT的拓扑学分析图。图中：灰线代表靠近周质空间一侧的亲水性环(Loop)；黑色线组成的长方形代表疏水性跨膜区；粗线代表靠近细胞质一侧的亲水性环(Loop)。图9是本专利技术实施例提供的MceT蛋白的表达和亚细胞定位检测图。图中：(a)图为KNabc/pTrcHisB-mceT和KNabc/pTrcHisB各组分蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种游动球菌耐盐碱基因mceT，其特征在于，所述的游动球菌耐盐碱基因mceT，含一个921bp的完整开放阅读框ORF，ORF的核苷酸序列为SEQIDNO.1。

【技术特征摘要】
1.一种游动球菌耐盐碱基因mceT，其特征在于，所述的游动球菌耐盐碱基因mceT，含一个921bp的完整开放阅读框ORF，ORF的核苷酸序列为SEQIDNO.1。2.一种利用权利要求1所述游动球菌耐盐碱基因mceT编码的蛋白，其特征在于，所述的蛋白氨基酸序列为SEQIDNO.2。3.如权利要求2所述的蛋白，其特征在于，所述蛋白具有Na+(Li+、K+)/H+逆向转运蛋白活性，且Na+(Li+、K+)/H+逆向转运蛋白活性具有pH依赖性。4.如权利要求2所述的蛋白，其特征在于，所述蛋白具有促进Zn2+吸收转运能力。5.一种如权利要求1所述游动球菌耐盐碱基因mceT的鉴定方法，其特征在于，所述游动球菌耐盐碱基因mceT的鉴定方法包括以下步骤：(1)通过基因文库与基因功能互补相结合的筛选技术，从游动球菌中获得含有耐盐碱相关的基因片段，所述的耐盐碱相关的基因片段中含有一个长921bp的mceT基因的完整开放阅读框ORF，ORF的核苷酸序列如SEQIDNO.1；(2)构建含有游动球菌耐盐碱基因mceT基因的原核表达载体；(3)通过化转异源宿主EscherichiacoliKNabc，将携带基因mceT的质粒电击转化的方法导入至KNabc宿主中，...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜巨全，徐桐，邵丽，孟琳，张瑞，张正来，洪闪，邹俏，郑秀桃，郭思伽，王玉婷，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23